多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 擴(kuò)增片段

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段第1頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釶CR的基本原理，學(xué)習(xí)PCR的基本操作技術(shù)。第2頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其原理如下：將待擴(kuò)增的DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，沿模板5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和延伸反應(yīng)循環(huán)，可使兩引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個(gè)模板DNA分子經(jīng)20次循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)106。第3頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理

變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物PCR三步曲變性90～97℃退火45～65℃延伸72℃左右PCR過程第4頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)

PCR的反應(yīng)過程變性-復(fù)性-延伸多重循環(huán)(n)模板以2En擴(kuò)增短片段以指數(shù)式擴(kuò)增長片段以線性式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長度在P1-P2之間第5頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。它既可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控和研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制的探索及醫(yī)學(xué)鑒定等多方面，也被廣泛運(yùn)用于刑偵物證鑒定、親子鑒定及古分子系統(tǒng)學(xué)研究等其他領(lǐng)域。第6頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)材料、器材及試劑

待擴(kuò)增的模板DNA；DNA熱循環(huán)儀，電泳儀，電泳槽，臺(tái)式離心機(jī)，紫外檢測儀，1.5ml離心管架，移液器，1.5ml離心管，0.2ml離心管，槍頭等。dNTPs，Taq酶，引物一對，10×PCRReactionBuffer，TdH2O第7頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)體系的五要素：

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶來自水生棲熱菌Thermusaquaticus

良好的耐熱性

Mg2+依賴性無校讀功能第8頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月dNTP，deoxy-ribonucleosidetriphosphate（三磷酸脫氧核糖核苷）的縮寫。是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。在生物DNA、RNA合成中，以及各種PCR（RT-PCR、Real-timePCR）中第9頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.PCR反應(yīng)⑴PCR反應(yīng)混合液的配制（n為反應(yīng)數(shù)）：

n×2.0μl反應(yīng)緩沖液（即10×PCR反應(yīng)緩沖液

其中含15mMMgCl2）

n×2.0μl

dNTP(2mM,each)

n×1.5μl

引物F(2μM)

n×1.5μl

引物R(2μM)

n×0.1μl

Taq酶(5U/μl)

混勻,取19μl分別加入n個(gè)0.2mlPCR管中,各管加入模板DNA1μl,

輕輕用手摔一下.第10頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌薄壁管中順序加入反應(yīng)體系各成分:

雙/三蒸水

l

10×緩沖液 2.5l

25mmol/LMg2+ 2.5l

4×dNTP 2.0l

50umol/L引物1 2.0l

50umol/L引物2 2.0l

模板DNA 1-2

l

TaqDNA多聚酶 1.0l

25.0l輕彈管壁，使各成分充分混勻！

實(shí)驗(yàn)操作（1）PCR反應(yīng)體系：

四、實(shí)驗(yàn)步驟第11頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)操作（2）設(shè)定循環(huán)程序:

階一:94℃×3m

階二:(94℃×30s-

55℃×1m-

72℃×1m

)

×25~35循環(huán)階三:

72℃×5~10mPCR反應(yīng)在帶熱蓋的PCR儀上進(jìn)行,大約需要兩個(gè)半小時(shí).第12頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月操作提示1、一切器具均經(jīng)高壓滅菌-烘干-冷卻后使用；2、各試劑小份分裝，-20℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)?。?、酶的取用不離開冰浴；取液吸頭、離心管均一次性使用，及時(shí)更換；第13頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月2.PCR產(chǎn)物的檢測

⑶制備1.0%的瓊脂糖凝膠

⑷取5μl

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測儀下觀察,記錄結(jié)果.第14頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳結(jié)果有無目標(biāo)條帶出現(xiàn)，可判別+/-結(jié)果；根據(jù)條帶寬度和亮度，可直觀判斷擴(kuò)增產(chǎn)量；關(guān)于PCR假陰性、假陽性及非特異擴(kuò)增問題。電泳檢驗(yàn)PCR結(jié)果、分析與評價(jià)第15頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增NGF基因（大鼠）ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacgga

gactccgttc541

accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc

-3’Perim1:(5’)gatcggcgtacaggcagaac(3’)328-347Perim2:(3’)cgcggggtgaacggagtctc(5’)529-548

預(yù)期擴(kuò)增長度：220bp第16頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp220bp→第17頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于PCR假陰性、假陽性問題每組PCR都要設(shè)立陰性對照（加無關(guān)DNA，而不是不加DNA），以檢測有無污染；每組PCR都要設(shè)立陽性對照（加肯定的DNA或前次PCR產(chǎn)物），以檢測PCR的效率；對假陰性問題，可通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除錯(cuò)誤、改善反應(yīng)條件（用梯度實(shí)驗(yàn)選擇復(fù)性溫度）等排查、排除之；假陽性多數(shù)都是模板DNA污染的問題，查實(shí)后必須更換所有試劑；……第18頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于PCR非特異性擴(kuò)增問題：引物特異性引物純度兩條引物的Tm值模板純度模板二級結(jié)構(gòu)退火溫度（時(shí)間）反應(yīng)體系中引物、dNTP、Mg++、模板、Taq酶濃度。第19頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)延伸檢索了解PCR的進(jìn)展：逆轉(zhuǎn)錄PCR；巢式PCR；反向PCR；差示PCR；單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR；實(shí)時(shí)定量PCR；……

第20頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆轉(zhuǎn)錄酶特異性引物,Taq酶用途:獲得所需cDNA片段；檢測基因表達(dá)注意問題：1、PCR效率差異，重復(fù)性2、內(nèi)參選定3、共同擴(kuò)增4、擴(kuò)增片段位置5、mRNA豐度第21頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月巢式PCR采用兩對引物進(jìn)行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)P1上P1下P2上P2下用途：驗(yàn)證第一次PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行特殊PCR，如合成探針模板第22頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究第23頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月差示PCR（DD-PCR)

利用特殊設(shè)計(jì)的引物，在RT的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR，以研究不同基因的表達(dá)狀況。腫瘤組織正常組織第24頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(SSCP-PCR)第25頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR引物設(shè)計(jì)一對引物，分別與靶DNA5’和3’端互補(bǔ)長度：15～30個(gè)核苷酸引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無同源性引物的設(shè)計(jì)可以參照：兩分鐘StepByStep學(xué)會(huì)引物設(shè)計(jì)軟件

Primerpremier5.0/oligo軟件

核酸基因技術(shù)討論版/生物信息學(xué)討論版/PCR技術(shù)討論版第26頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)：1.長度在15-30bp，GC含量在45-55%之間。

Tm=4(G+C)+2(A+T)。2.堿基分布表現(xiàn)出隨機(jī)性，避免相同堿基連續(xù)排列。3.3’不能與引物內(nèi)部互補(bǔ)，以免形成二級結(jié)構(gòu)。4.兩個(gè)引物各自的3’不能互補(bǔ)，以免形成自身擴(kuò)增。5.引物必須經(jīng)GenBank查詢后，證實(shí)沒有與其他非目的DNA高度互補(bǔ)，才能使用。第27頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月使用blast程序，輸入引物序列，等待結(jié)果報(bào)告。GenBank網(wǎng)址：第28頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

/primo/

引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址：第29頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將pg=10-12級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(g=10-6)水平簡便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)對標(biāo)本的純度要求低：

DNA粗制品可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等擴(kuò)增檢測第30頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月五、注意事項(xiàng)

⑴使用的全部溶液都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染.⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是最高質(zhì)量的三蒸水.⑶

所有試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后再分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存,從而確保每次擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)之間的一致性.第31頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月

普通高中課程

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書 生物

選修1生物技術(shù)實(shí)踐

第32頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月專題4DNA與蛋白質(zhì)技術(shù)

課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課程標(biāo)準(zhǔn)具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)

嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作和應(yīng)用

?；顒?dòng)建議

用某一DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第33頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月課題2

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段教材內(nèi)容:

基礎(chǔ)知識

(一)PCR原理

(二)PCR的反應(yīng)過程

實(shí)驗(yàn)操作

操作提示

結(jié)果分析與評價(jià)

課題延伸

練習(xí) 第34頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月一、課題目標(biāo)本課題通過嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作，使學(xué)生體驗(yàn)PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，理解PCR的原理，討論P(yáng)CR的應(yīng)用教材分析第35頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)

課題重點(diǎn)：

PCR的原理和PCR的基本操作。課題難點(diǎn)：

PCR的原理。教材分析第36頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月三、課題背景分析課題背景首先介紹了PCR是一種在體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，然后說明這一技術(shù)在遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆等方面都有著廣泛的應(yīng)用，最后指出本課題的目標(biāo)是了解PCR技術(shù)的基本原理，并嘗試用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段。教師在導(dǎo)入本課題的學(xué)習(xí)時(shí)，可以先讓學(xué)生談一談對PCR的認(rèn)識以及PCR的應(yīng)用，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，然后再說明本課題的目標(biāo)。教材分析第37頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)建議

（一）PCR原理知識要點(diǎn)：

1.細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成 成分與反應(yīng)條件；

2.DNA的合成方向；

3.TaqDNA聚合酶的應(yīng)用。教材分析第38頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）PCR原理教學(xué)建議：

理解PCR的原理，需要首先了解細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件。教師在教學(xué)過程中，可以首先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2《遺傳與進(jìn)化》中的有關(guān)DNA復(fù)制的知識。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生需要進(jìn)一步了解DNA雙鏈的方向，能夠區(qū)分DNA的3′端和5′端。此外，學(xué)生還需要了解DNA聚合酶的特性，如只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈、而不能從頭合成DNA等。教學(xué)建議第39頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）PCR原理教學(xué)建議：TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化，是一個(gè)重要的知識點(diǎn)。教師可以結(jié)合專題2中課題2“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”Taq細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)過程，幫助學(xué)生加深理解。教學(xué)建議第40頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）PCR的反應(yīng)過程知識要點(diǎn)：

PCR的基本步驟及每個(gè)步驟所發(fā)生的變化。教材分析第41頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）PCR的反應(yīng)過程教學(xué)建議：這部分內(nèi)容的教學(xué)應(yīng)以讀圖識圖為主。教科書中圖5-9“PCR反應(yīng)過程圖解”詳細(xì)地描繪了參與PCR的各組成成分；每一輪反應(yīng)的三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸；每一輪中每一個(gè)步驟所發(fā)生的變化，即每個(gè)步驟所具有的作用。教師在教學(xué)中可以請學(xué)生在讀圖的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時(shí)，教師要及時(shí)給予解答。教學(xué)建議第42頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)PCR原理體內(nèi)DNA復(fù)制:模板DNA原料:dNTP酶:解旋酶、DNApol.

…起始引物、合成方向合成環(huán)境…第43頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月解鏈→模板變性引物-起始→引物-模板復(fù)性子鏈延伸→子鏈延伸(一)PCR原理第44頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月Hotwaterbacteria:

ThermusaquaticusTaqDNApolymeraseLifeatHighTemperaturesbyThomasD.BrockBiotechnologyinYellowstone?1994YellowstoneAssociationforNaturalScience/Bact303/b27第45頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月加樣器的使用第46頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果分析與評價(jià)此為紫外光吸收檢測的結(jié)果檢驗(yàn)法，實(shí)踐中很少用；

普遍采用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)PCR結(jié)果第47頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月網(wǎng)站鏈接北大生物信息中心/

生物通

/

生物谷

/

中華基因網(wǎng)/

中國生物論壇

/

生物引擎/more.html基因中國/

……

第48頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR應(yīng)用相關(guān)文章及鏈接：PCR技術(shù)的應(yīng)用/experiment/pcr8/183866.shtml

/show/download/shtml/001373.shtml

/Article/resource/ebook/200603/8232.shtml

PCR促進(jìn)新藥研發(fā)/content.aspx?id=3070

火眼金睛——PCR技術(shù)/news.php?id=577

DNA出庭作證/news.php?id=2006

AnimationofmolecularbiotechBiologyAnimationLibrary

/ddnalc/resources/dnaarray.html

第49頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月MolecularGeneticMethods-LectureTopics

ChapterPolymeraseChainReaction(PCR) 7DNAsequencing(manual/automated) 7DNAFingerprinting(DNAtyping/profiling) 8Singlenucleotidepolymorphisms(SNPs) 9第50頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月PracticalapplicationsofPCR,Sequencing,Fingerprinting,&SNPs:AmplifyDNAforCloning(PCR)AmplifyDNAforsequencingwithoutcloning(PCR)DNAsequencingreaction(PCR)MappinggenesandregulatorysequencesLinkageanalysis(identifygenesfortraits/diseases)DiagnosediseasePathogenscreeningSexdeterminationForensicanalysisPaternity/maternity(relatedness)Behavioralecologystudies(relatedness)Molecularsystematicsandevolution(comparinghomologoussequencesindifferentorganisms)Populationgenetics(theoreticalandapplied)Physiologicalgenetics(studyingbasisofadaptation)Livestockpedigrees(optimizebreeding)Wildlifemanagement(stockidentification/assessment)DetectionofGeneticallyModifiedFood(GMOs)第51頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月BackgroundonthePolymeraseChainReaction(PCR)AbilitytogenerateidenticalhighcopynumberDNAsmadepossibleinthe1970sbyrecombinantDNAtechnology(i.e.,cloning).CloningDNAistimeconsumingandexpensive(>>$15/sample).Probinglibrariescanbelikehuntingforaneedleinahaystack.PCR,“discovered”in1983byKaryMullis,enablestheamplification(orduplication)ofmillionsofcopiesofanyDNAsequencewithknownflankingsequences.Requiresonlysimple,inexpensiveingredientsandacouplehours.DNAtemplatePrimers(annealtoflankingsequences)DNApolymerasedNTPsMg2+BufferCanbeperformedbyhandorinamachinecalledathermalcycler.1993:NobelPrizeforChemistry第52頁，課件共58頁，創(chuàng)作于2023年2月HowPCRworks:BeginswithDNAcontainingasequencetobeamplifiedandapairofsyntheticoligonucleotideprimersthatflankthesequence.Next,denaturetheDNAtosinglestrandsat94?C.RapidlycooltheDNA(37-65?C)andannealprimerstocomplementarys.s.sequencesflankingthetargetDNA.Extendprimer