15病毒感染的實驗室診斷幻燈片

病毒感染的實驗室診斷病毒感染的實驗診斷方法病原學(xué)診斷

病毒分離培養(yǎng)顯微鏡檢查抗原檢測核酸檢測血清學(xué)診斷抗體檢測IgM、IgG一、標(biāo)本采集與運送（一）標(biāo)本采集采集時間：盡早采集（越早越好）標(biāo)本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇（二）標(biāo)本的運送與保存1.低溫送檢

4℃可保存數(shù)小時-70℃可長期保存

-10～-20℃下病毒易滅活，不可用于保存病毒標(biāo)本對冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融2.保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢病毒轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基（virustransportmedium，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hank’s液3.無菌送檢抑制細(xì)菌生長100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素二、病毒的分離與鑒定（一）病毒分離和鑒定的一般程序動物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗血凝抑制試驗CPEEM包涵體空斑試驗紅細(xì)胞吸附中和試驗觀察發(fā)病抗原檢測抗體檢測病理檢查1.組織培養(yǎng)將人或動物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術(shù)。組織培養(yǎng)的類型（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng)人胚氣管－呼吸道病毒；人胚腸－腸道病毒（3）細(xì)胞培養(yǎng)最常用原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)

動物新鮮組織（人胚腎等）→胰酶消化→營養(yǎng)液培養(yǎng)→單層細(xì)胞（原代細(xì)胞）原代細(xì)胞→胰酶消化→轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細(xì)胞）對病毒敏感，但制備費時費力，只能傳2～3代。二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞反復(fù)傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞系

來源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。

原代和次代培養(yǎng)細(xì)胞2.雞胚培養(yǎng)常用于粘病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)接種途徑及方法

新鮮受精卵接種病毒38～39℃7～13d卵黃囊接種羊膜腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷3.動物接種常用動物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病對動物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒乳鼠腹腔接種乙肝病毒黑猩猩靜脈注射流感病毒鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清（三）病毒的鑒定病毒的初步鑒定動物感染范圍及潛伏期對雞胚的敏感性在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)理化性質(zhì)的測定最后鑒定血清學(xué)鑒定:中和試驗、補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗等分離的新病毒，必須進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)（1）細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化）正常細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液由紅變黃病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，這種由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)變化，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)。（2）細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE）

細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE（3）空斑現(xiàn)象空斑（plaque）是指在單層細(xì)胞中，由活細(xì)胞包圍的由病毒感染引起的死細(xì)胞的區(qū)域。一個空斑由一個病毒顆粒感染所致，利用空斑可純化病毒。不同種類病毒形成的空斑大小和形狀不同，可用于鑒定病毒。（4）干擾現(xiàn)象當(dāng)兩種不同的病毒同時或先后感染同一細(xì)胞時，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現(xiàn)象。（5）紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗

受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗陽性（6）血凝及血凝抑制試驗

含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動物或禽類的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗，可用于分型。病毒的理化性質(zhì)測定主要用于新發(fā)現(xiàn)病毒的鑒定（1）病毒的大小及形態(tài)電鏡直接觀察（2）核酸類型

5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）能抑制DNA復(fù)制，而不抑制RNA病毒。（3）乙醚敏感試驗

有包膜病毒對乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸試驗?zāi)c道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活病毒的血清學(xué)鑒定中和試驗、補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗等三、病毒的血清學(xué)診斷單份血清IgM測定早期診斷雙份血清IgG測定4倍以上增長，有診斷意義病毒血清學(xué)試驗常用方法（一）中和試驗原理抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去感染性。

V.＋Ab→失去感染易感細(xì)胞的能力一定量抗體可中和一定量病毒。

中和試驗的必要條件：

1.活病毒

2.敏感細(xì)胞、雞胚或動物中和試驗的常用方法：固定V.，稀釋血清，測定抗體效價（常用）固定血清，稀釋V.，求中和指數(shù)中和試驗的優(yōu)缺點特異，敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。既可用細(xì)胞培養(yǎng)做，也可用動物或雞胚接種，以細(xì)胞最常用。檢測IgG，不能用于早期診斷，常用用于流行病學(xué)調(diào)查。（二）補體結(jié)合試驗檢測IgM，常用于早期診斷。不需活細(xì)胞，比中和試驗簡單，省時。（三）IF及ELISA方法簡單、快速、敏感性高。四、病毒感染的快速診斷（一）病毒的形態(tài)學(xué)檢查

1.光學(xué)顯微鏡檢查

病變組織中找包涵體。簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體

狂犬病毒胞漿內(nèi)包涵體（內(nèi)基小提）巨細(xì)胞病毒胞核內(nèi)包涵體2.電鏡及免疫電鏡檢查直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（＞106/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測）乙型肝炎病毒電鏡圖輪狀病毒電鏡圖（二）病毒抗原檢查

用免疫標(biāo)記技術(shù)檢測：DFA、IFA、IEA等可檢測細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。InfluenzavirusA培養(yǎng)物DFA染色陽性

InfluenzavirusB培養(yǎng)DFA染色陽性