放射免疫技術

放射免疫技術第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)放射免疫分析一、基本原理二、實驗方法及測定第三節(jié)免疫放射分析一、基本原理二、IRMA與RIA的比較思考題小結第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫技術：以抗原-抗體反應原理為基礎，對樣品中相應抗原或抗體進行檢測。標記技術：將可被探測的示蹤物質用化學方法與化合物連接。標記免疫分析：用可微量或超微量檢測的示蹤劑標記抗原、抗體，檢測免疫反應結果并確定待檢物。標記免疫技術－基本概念第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月常見標記免疫技術放射免疫技術酶免疫技術熒光免疫技術

第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)放射免疫技術

第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月早期的放射免疫技術是基于競爭性結合反應原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標準化等優(yōu)點，廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷領域中各種微量蛋白質、激素、小分子藥物和腫瘤標志物的定量分析，對相關學科的發(fā)展起到了極大地推動作用。

第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月放射免疫RIA以標記抗原與反應系統(tǒng)中未標記抗原競爭結合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標記抗體與抗原非競爭結合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結合標記抗體。放射受體分析RRA放射配體結合分析RBA其它一、放射免疫技術－原理及分類第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月二、放射免疫技術－常用的放射性核素

125I

3H射線γβ理化性

活潑

差核素豐度

>90%－半衰期60.2d12.3y標記方法簡單復雜標記設備低廉昂貴測量條件簡單復雜常用標記核素第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月125碘-標記物的制備－標記125I-化學或酶促反應，將放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。125I或125I+125I-標記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應直接標記法三、放射免疫技術－標記物制備及鑒定第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月使用無還原劑的高比放射性碘源被標記物用量要少ch-T用量要低控制總反應體積<200μl反應時間1-2分鐘弱堿性反應條件第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月間接標記法聯(lián)接標記(bolton-Hunter)預先將125I用ch-T法標記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應，從而使待標記物被碘化。bolton-Hunter第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月125碘-標記物的制備－純化凝膠過濾法離子交換層析法

聚丙烯酰胺凝膠電泳

高效液相色譜法聚合、損傷物標記蛋白游離125I第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月125碘-標記物的制備－鑒定

標記物質量高比放射性高純度完整免疫活性

放射化學純度單位標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率應大于95%

免疫活性標記物與抗體結合的能力標記物與過量抗體反應百分比該值越大,標記物免疫活性好第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

比放射單位化學量標記物中所含的放射性強度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過高，將影響標記物免疫活性計算法：依據標記反應中放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射性.自身置換法：比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性

結果準，測定復雜第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月比放射性－計算法

結果欠準，計算簡便第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

自身置換曲線

反應系統(tǒng)：限量Ab和遞增劑量(cpm)的標記抗原標記抗原的結合率(B/T%)隨標記抗原總量的增加而減少兩條曲線平行,若標記抗原與標準品抗原具有相同的免疫活性標準曲線

反應系統(tǒng):抗體（限量）、標記抗原（定量）和劑量遞增的標準抗原組成標記抗原與抗體的結合率(B/T%)隨標準抗原的增加而競爭抑制性減少第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月比放射性－自身置換法

標準曲線與自身置換曲線平行表明在相同的放射性結合水平上，二實驗中抗體上結合的抗原物質總量相同計算置換曲線平行段某結合率的放射性強度(cpm/ml換算為nCi/ml)計算標準曲線平行段相應結合率對應的標準抗原化學量

(ng/ml)以平行段多點結合率對應的放射強度和標準抗原量進行直線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng)第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月四、放射免疫技術－抗血清鑒定

抗體分子上一個抗原結合部位與相應的抗原決定簇之間的結合強度用親和常數(shù)Ka表示。單位為稀度單位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高靈敏度、精確度和準確度親和性親合力高親合力低第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月放射免疫技術－抗血清鑒定特異性:指一種抗體識別相應抗原決定簇的能力交叉反應率：將反應的最大結合率抑制下降50%

時特異性抗原與類似物的劑量（ED50）之比抗體交叉反應程度直接影響測定結果的準確性特異性效價第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月五、方法學評價除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應注意以下指標：可靠性劑量-反應曲線高劑量鉤狀效應第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

放射免疫分析第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月一、放射免疫分析－基本原理競爭性結合反應的經典標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結合Ag*和Ag具有等同的與Ab結合能力第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結合位點，二者通過競爭方式與Ab結合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。

第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關系－劑量反應曲線注：T即是B與F的總和第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月二、放射免疫分析－實驗方法及測定抗原抗體反應Ag*Ag反應條件體積溫度時間pHAb(標準Ag/樣品Ag)平衡非平衡一步法二步法第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月分離結合、游離標記物二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響操作應簡單、重復性好經濟第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月測量、數(shù)據處理晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

計算

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)擬合注：T即是B與F的總和第27頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

免疫放射分析第28頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月一、免疫放射分析－基本原理以過量125I標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結合反應,用固相免疫吸附劑對B或F進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。第29頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月單位點IRMA先用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物；用固相抗原結