大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理、步驟以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

一、目的1.了解感受態(tài)細(xì)胞生理特性及制備條件，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法。2.掌握質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法，了解轉(zhuǎn)化的條件和利用半乳糖苷酶基因插入失活選擇重組質(zhì)粒DNA的原理。二、原理（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理所謂感受態(tài)，是指細(xì)菌生長過程中的某一階段的培養(yǎng)物，只有某一生長階段中的細(xì)菌才能作為轉(zhuǎn)化的受體，能接受外源DNA而不將其降解的生理狀態(tài)。感受態(tài)形成后，細(xì)胞生理狀態(tài)會發(fā)生改變，出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶，負(fù)責(zé)供體DNA的結(jié)合和加工等。細(xì)胞表面正電荷增加，通透性增加，形成能接受外來的DNA分子的受體位點等。本實驗為了把外源DNA（重組質(zhì)粒）引入大腸桿菌，就必須先制備能吸收外來DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞。在細(xì)菌中，能發(fā)生感受態(tài)細(xì)胞是占極少數(shù)。而且，細(xì)菌的感受態(tài)是在短暫時間內(nèi)發(fā)生。目前對感受態(tài)細(xì)胞能接受外來DNA分子的本質(zhì)看法不一。主要有兩種假說：1、局部原生質(zhì)體化假說――細(xì)胞表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能通過質(zhì)膜進(jìn)細(xì)胞。證據(jù)有：（1）發(fā)芽的芽孢桿菌容易轉(zhuǎn)化；（2）大腸桿菌的原生質(zhì)體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA轉(zhuǎn)化；（3）適量的溶菌酶能提高轉(zhuǎn)化率。2、酶受體假說――感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。證據(jù)是：（1）蛋白質(zhì)合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉(zhuǎn)化作用；（2）細(xì)胞分裂過程中，一直有局部原生質(zhì)化，但感受態(tài)只在生長對數(shù)期的中早期出現(xiàn)；（3）分離到感受態(tài)因子，能使非感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芗?xì)胞。目前對感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化理論尚未有統(tǒng)一結(jié)論，但是許多實驗室一直進(jìn)行探索，試圖從實驗中獲得明確回答。有人根據(jù)pBR322質(zhì)粒DNA對E?coliK――12X1776菌株的轉(zhuǎn)化結(jié)果，認(rèn)為：

近來，在許多研究室都發(fā)現(xiàn)CaCl2對受體菌處理，可提高轉(zhuǎn)化效率幾十倍，通常把細(xì)胞懸浮在pH6.0的100mmol/LCaCl2中，在冰浴條件下，放置過夜，轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)高，但一過24小時，轉(zhuǎn)化率測恢復(fù)為原來的水平。（二）重組DNA的轉(zhuǎn)化原理我們已經(jīng)制備好大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，接下的實驗是把重組的DNA引入受體細(xì)胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選出轉(zhuǎn)化子。作為受體的大腸桿菌C600或DH5α，必須不同外來DNA分子發(fā)生遺傳重組，通常是rec基因缺陷型的突變體，同時它們必須是限制系統(tǒng)缺陷或限制與修飾系統(tǒng)均缺陷的菌株。這樣外來的DNA分子不會受其限制酶的降解。保持外來DNA分子在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定性。制備的大腸桿菌細(xì)胞就具有這三種缺陷（rk-mk-rec-）同時此受體細(xì)胞還是氨芐青霉素敏感（Ap）。在體外構(gòu)建好的重組分子上具有分解氨芐青霉素（Ap）基因存在，當(dāng)它導(dǎo)入受體細(xì)胞后，就賦于這些受體細(xì)胞新的特性，即Ap抗性。同時載體質(zhì)粒上具有乳糖操縱的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我們可以利用外源基因插入載體β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理來選擇新構(gòu)建的重組子。因pUC18帶有Ampr基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pUC18DNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。pUC18上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pUC18和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pUC18和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac細(xì)菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段TGFβⅠ插入到pUC18質(zhì)粒的多克隆位點上后會導(dǎo)致讀碼框架改變,表達(dá)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力,因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。由此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。此為α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。本實驗是把外來重組分子和感受態(tài)細(xì)胞在低溫下混合，使其進(jìn)入受體細(xì)胞。DNA分子轉(zhuǎn)化的原理較復(fù)雜：1、吸附――完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌表面。2、轉(zhuǎn)入――雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA分子進(jìn)入受體菌，另一鏈降解。3、自穩(wěn)――外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA。4、表達(dá)――供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄和翻譯。對DNA分子來說，能被轉(zhuǎn)化進(jìn)受體細(xì)胞的比率極低，通常只占DNA分子的0.01%，改變條件，提高轉(zhuǎn)化率是很有可能的，一些研究表明下列因素可以提高轉(zhuǎn)化率：（1）受體菌細(xì)胞與DNA分子兩者比例在1.6×108細(xì)胞：1毫微克DNA分子（4.3Kb）左右轉(zhuǎn)化率較好；（2）DNA分子與細(xì)胞混合時間為1小時最佳；（3）鋪平板條件會影響轉(zhuǎn)化率；（4）對不同轉(zhuǎn)化菌株熱處理（效應(yīng)不一致）。除上述因素外，轉(zhuǎn)化試驗還注意如下問題：1、連接DNA反應(yīng)液與受體細(xì)胞混合時，一定保持在冰浴條件下操作，如果溫度時高時低，轉(zhuǎn)化效率將極差。2、熱處理2分鐘后，要迅速加進(jìn)1毫升LB以使表型表達(dá)，延遲加LB，將使轉(zhuǎn)化率迅速降低。3、在平板上涂布細(xì)菌時。注容避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械壓涂布將會使細(xì)胞破裂。影響轉(zhuǎn)化率。三、材料（一）儀器與器皿恒溫振蕩器分光光度計電動沉淀離心機(jī)旋渦混合器恒溫培養(yǎng)箱隔電熱恒溫水浴鍋恒溫?fù)u床普通冰箱Eppendorf管轉(zhuǎn)液管平皿涂布棒微量取樣器微波爐三角燒瓶試管刻度離心管保溫瓶酒精燈等（二）菌種大腸桿菌C600或DH5α（rkrecmk）（三）培養(yǎng)基與試劑1.LB液體培養(yǎng)基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5。）2、100mmol/LCaCl23.氨芐青霉素溶液（50毫克/毫升）4.DNA連接反應(yīng)液5.X-gal儲液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液,包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞,儲存于-20℃。6.IPTG儲液(200mg/ml):在800μl蒸餾水中溶解200mgIPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。7.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50μg/ml,搖勻后鋪板。8.含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收，備用。四、實驗步驟（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備1、將受體大腸桿菌接種于LB斜面上活化，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。2、取一環(huán)上述大腸桿菌培養(yǎng)物菌落接種于3毫升LB試管中，于恒溫振蕩器上，37℃振蕩培養(yǎng)過夜（約16小時），必要時在顯微鏡下鏡檢菌細(xì)胞是否形態(tài)一致，有無雜菌污染。3、用移液管無菌條件下，取過夜培養(yǎng)液1毫升，接種于新鮮的LB中（100毫升LB/250毫升三角瓶，接種量按菌液濃度而定，一般在1%左右），于恒溫振蕩器上37℃培養(yǎng)2―3小時。4、取1毫升培養(yǎng)液以未接種的LB作空白對照，在751分光光度計上測OD550的光密度值，約為0.2―0.5左右。5.無菌條件下將上述1毫升菌液倒入1.5毫升EP離心管中（離心管應(yīng)帶蓋并高壓滅菌過），每組2支。6、帶菌液的離心管置于冰上10分鐘，冷卻菌液，平衡好，置于臺式低速離心機(jī)上，3500r/min離心5分鐘。7、無菌條件下，倒去上清LB，倒斜離心管，讓LB流干，留下沉淀菌體，加入預(yù)冷的100mmol/LCaCl2溶液600微升，用微量取樣器輕輕吸沖底部沉淀菌體，使其懸浮后，把2支管轉(zhuǎn)為1支，搖勻后于冰浴中放置30分鐘。8、重新將CaCl2菌懸浮液置于臺式低速離心機(jī)上，3500r/min離心10分鐘，小心側(cè)倒掉上清CaCl2，留沉淀菌體。9、再把菌體懸浮在200微升100mmol/LCaCl2的溶液中，置于冰上作為轉(zhuǎn)化的受體菌液。此制備的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在此步后1小時至24小時內(nèi)使用，效率比較高。10.在事先制備好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收，備用。（二）重組DNA轉(zhuǎn)化1.取0.2ml大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在無菌條件下，加入到連接液的Eppendorf管，混勻，置冰浴中30分鐘。2.冰浴后，將正在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的細(xì)胞懸浮液加入已調(diào)好42℃的的恒溫水浴槽內(nèi)，保溫2分種。3.熱沖擊處理后的細(xì)胞易死亡，應(yīng)迅速倒入LB培養(yǎng)液1毫升，（無抗菌素LB液，有助于基因表達(dá)）馬上置37℃水浴1小時，每10分鐘翻轉(zhuǎn)1次。4.用移液器取0.1毫升的轉(zhuǎn)化菌液直接涂布含50μg/mlAmp、40mlX-gal儲液和4μlIPTG儲液LB固體平皿上，共涂布三個培養(yǎng)皿。5.用移液器取未經(jīng)轉(zhuǎn)化的受體大腸桿菌感受態(tài)菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40mlX-gal儲液和4μlIPTG儲液LB固體平皿上，作為受體菌對照。6.將第14、15步涂布培養(yǎng)皿先放室溫15分鐘左右，使涂布上的菌液干燥不會流動。然后倒置放于HYPERLINK