生物制品分析概論

生物制品分析概論第1頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、生物制品藥物分析有那些特點？2、為什么必須對生物制品進(jìn)行全程質(zhì)量控制？問題2第2頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)概述

化學(xué)藥物、生物藥物、中藥生物藥物（來源和生產(chǎn)方法）生化藥物生物合成藥物生物制品3第3頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物藥物利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。4第4頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

生物藥物發(fā)展過程：第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗提取物制劑：魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。第二代：根據(jù)生物化學(xué)和免疫學(xué)原理，應(yīng)用近代生化分離純化技術(shù)從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分。如：尿激酶、肝素鈉、胰島素、人血白蛋白等。第三代：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過蛋白質(zhì)工程原理設(shè)計制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的全新的藥理活性成分。如：重組人生長激素、重組人胰島素等。5第5頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月海普瑞肝素鈉原料藥提取和純化技術(shù)在國際上是領(lǐng)先的2008年之前,海普瑞年盈利6000萬元,是一家典型的小公司,高盛于2007年第四季度入股后,美國就很“巧合”地發(fā)生了“百特肝素鈉事件”,超過20人死亡,300多人過敏。有人又很“巧合”說中國某一家原料藥廠家產(chǎn)品有問題,然后美國絕大多數(shù)人又很“巧合”開始偏愛APP公司的肝素鈉產(chǎn)品,而該公司又很“巧合”地只選擇海普瑞作為它唯一供貨商,因為據(jù)海普瑞公司自己說只有它才達(dá)到了美國的FDA認(rèn)證。有了這一系列的巧合,海普瑞就主營收入從2007年的3億元上升到2008年的4.3億,繼而躍升到2009年的22億多元,同時,盈利從2007年的0.6億元發(fā)展到2008年的1.6億,繼而在2009年爆漲到8億多元。后面的事也就沒有懸念了:海普瑞發(fā)行價達(dá)到了148元的歷史天價。6第6頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生化藥物定義：指從動物、植物及微生物提取的，也可用生物-化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核甘酸類。7第7頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物合成藥物定義:由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物,如:山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。8第8頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物制品定義用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。包括：細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細(xì)胞因子、體內(nèi)及體外診斷制品以及其他活性制劑微生態(tài)制劑:雙歧桿菌9第9頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物制品的種類和特點根據(jù)所采用的材料、制法或用途不同，可分為六類:疫苗類藥物抗毒素及抗血清類藥物血液制品重組DNA制品診斷制品其他制品10第10頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月疫苗類藥物定義:用病毒或立克次體接種于動物、雞胚，或經(jīng)組織培養(yǎng)后加以處理制造。分類:（1）細(xì)菌類疫苗：由有關(guān)細(xì)菌、螺旋體或其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等。如：皮內(nèi)注射卡介苗、吸附破傷風(fēng)疫苗、乙型腦炎減毒疫苗、人用狂犬病疫苗等。

11第11頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）減毒類疫苗：由病毒、衣原體、立克次體或其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等。如：口服脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗麻疹減毒活疫苗風(fēng)疹減毒活疫苗腮腺炎減毒活疫苗重組乙型肝炎疫苗甲型肝炎減毒活疫苗流感全病毒滅活疫苗12第12頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）聯(lián)合疫苗：指兩種或兩種以上疫苗原液按特定比例配合制成的具有多種免疫原性的滅活疫苗或活疫苗。如：傷寒副傷寒甲乙聯(lián)合疫苗吸附百白破聯(lián)合疫苗麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒疫苗

13第13頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

（4）雙價疫苗及多價疫苗：由單一型抗原成分組成的疫苗通稱單價疫苗。有兩個或兩個以上同一種但不同型抗原合并組成的含有雙價或多價抗原成分的一種疫苗，則分別稱為雙價疫苗或多價疫苗。14第14頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月抗毒素及抗血清類藥物定義：凡用細(xì)菌類毒素或毒素免疫馬或其他大動物所得的免疫血清叫抗毒素或抗毒血清。如：破傷風(fēng)抗毒素白喉抗毒素肉毒抗毒素凡用細(xì)菌或病毒本身免疫馬或其他大動物所得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清。如：抗蝮蛇毒血清抗五步蛇毒血清抗狂犬病血清15第15頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月血液制品定義：由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白成分，以及血液細(xì)胞有形成分統(tǒng)稱為血液制品。如：人血白蛋白人免疫球蛋白人凝血因子Ⅷ16第16頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）生物制品的特點分子量不是定值。大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等）。組分相同，但相對分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進(jìn)行相對分子量的測定。生化法結(jié)構(gòu)確證。由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用化學(xué)藥物或結(jié)構(gòu)已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學(xué)分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。17第17頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

需檢查生物活性。生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感，各種理化因素的變化易對生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質(zhì)。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質(zhì)失活要求安全性檢查。生物制品組分復(fù)雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質(zhì)含量比較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細(xì)胞外源因子檢查、原液、半成品、成品中有關(guān)血清白蛋白殘留量、CHO細(xì)胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗、異常毒性檢查等。18第18頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

需做效價測定。對于生物制品有效成分的檢測，除應(yīng)有一般化學(xué)方法或理化分心進(jìn)行有效成分含量測定外，更應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應(yīng)或?qū)Ｒ换磻?yīng)擬定其專屬性的生物效價測定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原復(fù)合物的效價測定。19第19頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三、生物制品的全程質(zhì)量控制生物制品化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應(yīng)有嚴(yán)格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對性強(qiáng)、毒性低、副作用小，療效可靠及營養(yǎng)價值高等特點的安全、高效的生物制品。為此，必須進(jìn)行原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制，以確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。20第20頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物制品及檢定規(guī)程草案（1952年）生物制品制造檢定規(guī)程（1959年）中國生物制品規(guī)程（2000年）中華人民共和國藥典三部（2005年）收載生物制品101種21第21頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月藥典三部各論內(nèi)容品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運輸及有效期使用說明（僅預(yù)防類含此項）22第22頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

生物制品品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運輸及有效期使用說明（僅預(yù)防類含此項）化學(xué)藥品品名化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式性狀鑒別檢查含量測定23第23頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月1234524第24頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月6725第25頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月26第26頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月生物制品質(zhì)量控制重點有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證有效成分的均一性、純度檢查有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)等的控制高效、靈敏的生物活性及比活性等實驗方法生物制品質(zhì)量控制基本方法：鑒別試驗雜質(zhì)檢查安全性檢查含量測定（生物活性或效價）27第27頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)鑒別試驗依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點，利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法進(jìn)行某些特殊反應(yīng)，或測定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點、電泳遷移率、色譜保留時間和肽圖等，判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)?。（一組實驗）28第28頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月一、理化鑒別法1、化學(xué)鑒別法

利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。如胰島素的沉淀反應(yīng)。2、紫外分光光度法

蛋白質(zhì)生物制品主要由芳香族氨基酸側(cè)鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸產(chǎn)生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。3、高效液相色譜法

（主峰保留時間和肽圖的一致性）

例如腦蛋白水解液不同批次肽圖的一致性

29第29頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月30第30頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月二、生化鑒別法1、酶法利用酶對底物特異性的催化活力，做為酶類生物制品簡便、快速鑒別方法。如尿激酶的鑒別使纖維蛋白原溶解2、電泳法

等電點聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等?？捎糜诘鞍踪|(zhì)類生物制品的鑒別。如重組人生長激素的鑒別：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

31第31頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月32第32頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月33第33頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月三、生物鑒別法（一）血清學(xué)法-體外抗原抗體試驗抗原抗體類生物制品的鑒別抗原抗體在體外結(jié)合時，可因抗原物理性狀不同或參與反應(yīng)的成分不同而出現(xiàn)各種類型的反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)，即經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，又衍生出免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高度敏感的檢測技術(shù)。

34第34頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）生物學(xué)法利用生物體對生物制品特定的生物活性的反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行供試品的鑒別來鑒別藥物。例如:小鼠驚厥試驗鑒別胰島素肝素延長血凝鑒別肝素35第35頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)雜質(zhì)檢查可用來判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來自生物體，生物活性特特異性強(qiáng)，制造與純化工藝復(fù)雜，分子結(jié)構(gòu)常常不確定，有時產(chǎn)品并非單一，極微量雜質(zhì)可能產(chǎn)生顯著的效應(yīng)，因此，其雜質(zhì)檢查顯得尤為重要。主要包括：一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查安全性檢查36第36頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

一般雜質(zhì)檢查

氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及干燥失重、熾燒殘渣37第37頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月一、特殊雜質(zhì)檢查從原料中帶入或生產(chǎn)工藝中或貯藏過程中引入的雜質(zhì)根據(jù)生物制品的生產(chǎn)工藝特點與產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其特殊雜質(zhì)分為：生物污染物：微生物污染、宿主細(xì)胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：二聚體和多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、裂解產(chǎn)物等工藝添加劑：殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁，產(chǎn)品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素，防腐劑苯酚、硫柳汞，細(xì)菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。38第38頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）宿主細(xì)胞蛋白殘留量測定生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞、工程菌相關(guān)的特殊雜質(zhì)。方法：ELISA39第39頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）外源性DNA殘留量的檢查測定方法：分子雜交技術(shù)基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)實時定量PCR方法40第40頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢查

生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。常用HPLC法和電泳法。如重組人生長激素中相關(guān)蛋白質(zhì)的測定總相關(guān)蛋白質(zhì)含量不超過10%。41第41頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）殘余抗生素的檢查如果生物制品在生產(chǎn)過程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中除去，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測方法。常用方法：抑菌圈測量。結(jié)果判定：對照溶液有抑菌圈，陰性對照無抑菌圈，供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照溶液抑菌圈的直徑42第42頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月二、安全性檢查（一）熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（二）異常毒性檢查（三）過敏試驗

檢查異性蛋白（四）降壓試驗

檢查組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓下降的物質(zhì)（五）無菌試驗檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法43第43頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)含量（效價）測定（一）含量測定表示方法：百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解變成小分子的藥物測定方法：1、HPLC2、SDS（二）效價測定表示方法：生物效價或酶活力：適用于酶類或蛋白質(zhì)類藥物。44第44頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月一、理化分析法（一）滴定分析法根據(jù)生物制品中某些成分能與標(biāo)準(zhǔn)溶液定量地發(fā)生酸堿中和反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等特性，通過滴定進(jìn)行含量測定。如胰酶中胰脂肪酶的測定。以橄欖油為底物，經(jīng)胰脂肪酶水解后產(chǎn)生脂肪酸，用氫氧化鈉液滴定。45第45頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）光譜分析法1、比色法例如：硫酸軟骨素的測定2、紫外分光光度法糜蛋白酶與底物N-乙酰-L-酪氨酸237nm測定3、熒光分光光度法反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物激發(fā)產(chǎn)生應(yīng)觀熒光應(yīng)用熒光試劑產(chǎn)生熒光應(yīng)用另一酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生熒光46第46頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月

（三）HPLC法特點：適合于對高沸點、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差

色譜柱：C8、C18流動相：甲醇-水（或緩沖液）、乙腈-水（或緩沖液）檢測器：UV、熒光、ECD色譜條件：47第47頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）多肽及蛋白質(zhì)等生物藥物的分離及其分子量測定特點：活性蛋白質(zhì)可以回收流動相通常為緩沖液，為改善分離，可加少量有機(jī)改性劑或表面活性劑根據(jù)有效粒徑分離

48第48頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月HPGFC測定rh-TNF衍生物的分子量色譜條件：色譜柱：SEC-3000柱流動相：0.01mmol/LKH2PO4：0.1mmol/LNa2SO4（1：1），內(nèi)加0.05%疊氮化鈉流速：1mL/min柱溫：檢測波長:280nm色譜條件：49第49頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月50第50頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月二、生化分析法

51第51頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）酶法酶法

酶活力測定法—以酶為分析對象

酶分析法—以酶為分析工具或分析試劑酶活力測定法酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度以單位時間底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

酶活力52第52頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應(yīng)的影響因素（1）底物濃度的影響：選擇Km小的作底物

（2）pH的影響（3）溫度的影響：溫度控制在±0.1度（4）輔助因子的影響（5）空白和對照試驗

空白：雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量

對照實驗：用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測定。用于比較或測定的標(biāo)準(zhǔn)。

53第53頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月酶法測定方法（1）取樣測定法

停止酶反應(yīng)的方法：添加變性劑加熱使酶失效（2）連續(xù)測定法54第54頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測方法1、UV-VIS—根據(jù)產(chǎn)物和底物特征吸收差別2、熒光3、旋光法4、酶偶聯(lián)測定法例如：ELASA5、其他：電化學(xué)法、離子選擇電極測定等55第55頁，課件共63頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）酶分析法以酶為分析工具的方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化