三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)課件

第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。1PCR2原理：1）合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；2）反應(yīng)體系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3）反應(yīng)程序：

變性94~95oC

復(fù)性

延伸

37~55oC70~72oC

72oC延伸10minDNA擴(kuò)增100萬(wàn)倍3PCR擴(kuò)增4PCR特點(diǎn)及應(yīng)用：特點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定可靠，快速；

2）微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物;應(yīng)用：（1）基因組DNA分析；（2）遺傳物質(zhì)的鑒定；（3）遺傳病的診斷;缺點(diǎn)：（1）需靶DNA序列的信息；（2）產(chǎn)物短小，DNA復(fù)制不精確。5PCR相關(guān)技術(shù)：

1.增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問(wèn)題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充產(chǎn)物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。62.巢式PCR（nestPCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。7在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來(lái)檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或在檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。83、多重PCR

4.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴(kuò)增（達(dá)ng～ug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。9RT-PCR10RT-PCR11cDNA五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）

是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代，微小的缺失或插入的檢測(cè)。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而作出判斷。12PCR-SSCP過(guò)程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

13解鏈構(gòu)像DAN原理過(guò)程第二節(jié)

DNA多態(tài)

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個(gè)個(gè)體（體細(xì)胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一個(gè)是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒(méi)有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。除一卵雙生子外，沒(méi)有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。14DNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。15一、序列多態(tài)（或點(diǎn)多態(tài)）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。由于堿基的變異可能倒致限制酶切點(diǎn)的消失或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn)，從而引起不同個(gè)體的DNA在用同一限制酶切割時(shí)，產(chǎn)生DNA片段長(zhǎng)度的差異。這種由于酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差異稱為RFLP。

RFLP按孟德?tīng)枺ü诧@性）方式遺傳，是非常有用的遺傳標(biāo)記。16AlleleII產(chǎn)生了新的酶切點(diǎn)

17

AlleleI

AlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb

RFLP—Southernblot檢測(cè)結(jié)果AlleleII酶切位點(diǎn)消失

18

二、序列長(zhǎng)度多態(tài)性（或數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)，variablenumbertendomrepeats,VNTR）

重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列。散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)。如圖：VNTR兩側(cè)的酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。19VNTR酶切，電泳后的檢測(cè)結(jié)果

20大小PCR-VNTR檢測(cè)21

通常，重復(fù)單位16～28bp長(zhǎng)，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復(fù)單位２～6bp長(zhǎng)，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。

DNA多態(tài)可以通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出，稱擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）

22PCR-VNTR23生物芯片技術(shù)

九十年代以來(lái)，發(fā)展了一種新的分子生物學(xué)技術(shù)，引起了人們的極大關(guān)注。生物芯片，實(shí)際上是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過(guò)在一微小的固體載體表面固定大量的分子識(shí)別探針，構(gòu)建一組微分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物，蛋白質(zhì)，核酸，細(xì)胞或其他生物組分準(zhǔn)確，快速，大量的篩選或檢測(cè)?；蛐酒ㄓ址QDNA芯片，生物芯片，DNA探針微列陣），它集成了大量的密集排列的基因探針，通過(guò)與被檢測(cè)基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識(shí)別。能在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因，實(shí)現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測(cè)。24基因芯片如：靶基因基因組

特異性片段探針

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