第二節(jié)基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

第二節(jié)基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第2頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)外切核酸酶第六節(jié)單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)RNA酶第3頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制

限制/修飾系統(tǒng)

(R-M,Restriction-modificationsystem)第4頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類(lèi)似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象第5頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。第6頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第7頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

第8頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

第9頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

基因工程中，應(yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體。

第10頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型

限制性核酸內(nèi)切酶（限制性酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)雙功能（具甲基化）異源三聚體ATPMg2+SAM距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割單一功能同源二聚體Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化）異源二聚體ATPMg2+

距識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割基因工程中使用注：SAM為S－腺苷甲硫氨酸第11頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶1.I型限制性?xún)?nèi)切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。如EcoB和EcoK。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的特異序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

第12頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)

在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開(kāi)一條單鏈。

（3）作用機(jī)理

需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

Recognizesite

cut

1-1.5kb

第13頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2.II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。分離的第一個(gè)酶是HindⅡ

（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

或第14頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)

識(shí)別位點(diǎn)處。

切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端第15頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用第16頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶3.III類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA(識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp)，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACC

EcoP15:CAGCAG

在基因工程操作中用途不大。第17頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)多功能（具甲基化）異源三聚體ATPMg2+SAM距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割單一功能同源二聚體Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化）異源二聚體ATPMg2+

距識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割核酸限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型及主要特性第18頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名

1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：

1.用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。

大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；

流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.

用一個(gè)右下標(biāo)的大寫(xiě)字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（現(xiàn)在都寫(xiě)成平行，如EcoRI）。

3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。

4.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，

修飾酶前面要帶上M（Modification）(現(xiàn)已省略)。第19頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名

EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)

若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。第20頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（一）識(shí)別序列識(shí)別順序的堿基數(shù)一般為4-6bp，少數(shù)識(shí)別更長(zhǎng)，多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性（回文結(jié)構(gòu)），少數(shù)的識(shí)別位點(diǎn)在切割位點(diǎn)之外，具旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性

4bp

HpaⅠ

CCGG

HaeⅢ

GGCC

5bp

AvaⅡ

GGWCC

EcoRⅡ

CCWGG

6bp

BamHⅠ

GGATTC

SmaⅠ

CCCGGG

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNNNGGC

12bp

BstXⅠ CCANNNNNNTGC

N=A,T,G,C第21頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（二）切割方式

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3‘位酯鍵產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。

第22頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶1.5’突出的末端第23頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’EcoRI37℃5‘…G--C--T--G--OHP--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—POH--G--C--T--C…5’退火4--7℃5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第24頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2.3’突出的末端第25頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’PstI37℃5‘…C--T--G--C--A--OHP--G…3’3‘…G--POH--A--C--G--T--C…5’退火4--7℃5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’第26頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端的意義

①連接便利

i）不同的DNA雙鏈：

只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。

這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。

第27頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶第28頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：

通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。

第29頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶②5’末端標(biāo)記

凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。

凸出的3’端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③

補(bǔ)平成平齊末端

粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。第30頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶3.平頭末端第31頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C…5’PvuII37℃5‘…G--C--T--C--A--G--OHP--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--POH--G--A--C--C--T--C…5’第32頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第33頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（二）切割方式

同裂酶（isoschizomers）：指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生不同或相同的末端。

同尾酶（isocaudamer）：指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大(相容性末端)。第34頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶同尾酶舉例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、

BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個(gè)核苷酸組成的粘性末端。第35頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

1U

核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時(shí)，使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用U表示。

大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/L

DTT1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h（DDT：二硫蘇糖醇

BSA：牛血清蛋白)0-50mM低鹽酶100

mM中鹽酶150

mM高鹽酶Buffer第36頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

在滅菌的1.5ml離心管中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng):

20μl體積反應(yīng)體系如下：

DNA0.2-1μg

10×酶切buffer2.0μl

限制性?xún)?nèi)切酶

1-2U（單位）

加ddH2O至

20μl

多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。第37頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

酶切反應(yīng)的終止

EDTA（終濃度10mmol/L)或SDS[終濃度0.1%(W/V)]65oC溫育

20min

酚/氯仿抽提，乙醇沉淀

酶解結(jié)果鑒定

瓊脂糖電泳第38頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開(kāi)。

局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開(kāi)。

通過(guò)縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。第39頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

酶切的注意事項(xiàng):

1.購(gòu)買(mǎi)的限制性?xún)?nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。

進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，

再?gòu)?/p>

-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更換一個(gè)無(wú)菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

2.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。

3.通常延長(zhǎng)時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。

第40頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（一）酶的純度

（二）DNA樣品的純度

DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間第41頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（三）DNA樣品的甲基化程度

采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。

第42頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（四）酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間

多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37℃，如SmaI為25℃或30℃，SfiI為50℃

。反應(yīng)溫度過(guò)度或過(guò)低都會(huì)影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活。酶解時(shí)間可通過(guò)加大酶量而縮短，反之酶量較少時(shí)，可通過(guò)延長(zhǎng)酶解時(shí)間以達(dá)到完全酶解DNA的目的。第43頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（五）DNA的分子構(gòu)型

某些酶切割超螺旋質(zhì)粒DNA時(shí)，酶量比切割線(xiàn)性DNA時(shí)高出多倍，可高達(dá)20倍。酶最適溫度oC

酶最適溫度oC

酶最適溫度oC

ApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525第44頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（六）限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液

高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性”

（staractivity）現(xiàn)象。

EcoRI*代表EcoRI的星號(hào)活力。

星活性的特點(diǎn):限制酶識(shí)別序列特異性降低

例如：EcoRI（高pH值或低鹽離子強(qiáng)度）

5’GAATTC3’變成5’NAATTN3’，另有一種情況是對(duì)AATT中的A、T分辨不嚴(yán)格商品化的限制酶一般都帶有專(zhuān)用緩沖液。第45頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用：重組DNA前的切割

構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性?xún)?nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究第46頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶剪刀—限制性?xún)?nèi)切酶針線(xiàn)、膠水—連接酶第47頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶第48頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶一、概念與機(jī)理

DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一種能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來(lái)源。第49頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶一、概念與機(jī)理

DNA連接酶只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。

注意：缺口（或稱(chēng)切口）和裂口的區(qū)別?。。。?！第50頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶對(duì)不同DNA分子的連接作用第51頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶二、DNA連接酶的種類(lèi)（一）T4噬菌體DNA連接酶

特點(diǎn)：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

用途：

1)粘性末端的連接

2)平頭末端的相連

抑制劑:PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca2+>0.1mM第52頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶二、DNA連接酶的種類(lèi)(二）大腸桿菌DNA連接酶連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子(三）熱穩(wěn)定DNA連接酶以NAD為輔助因子，優(yōu)先作用于缺口連接酶使用注意事項(xiàng)

1)DNA連接酶不能催化兩單鏈DNA分子連接；

2)只能連接雙鏈DNA分子的單鏈切口(nick)；

3)不能連接雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所致的裂口（gap）。DNA連接酶的部分性質(zhì)連接酶底物輔助因子巰基試劑粘性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體大腸桿菌DNA連接酶可行可行不行不行NAD+Mg2+不需要T4DNA連接酶可行可行可行可行ATPMg2+

需DTT噬熱菌DNA連接酶可行不行不行不行NAD+Mg2+

需要第53頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶應(yīng)用圖解（一）分子間的連接

（二）分子內(nèi)的連接第54頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶三、DNA連接酶的反應(yīng)體系

10×T4DNALigaseBuffer1μlpMD18-T（30ng/μl）1μl已純化的PCR產(chǎn)物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnitsddH2O 至10μl第55頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶四、影響連接反應(yīng)的因素

1.插入片段與載體的濃度比例：2-10:1增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象

2.反應(yīng)溫度：一般4~16℃

3.ATP濃度

第56頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補(bǔ)充)1.同聚物加尾法

第57頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補(bǔ)充)2.銜接物連接法

第58頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補(bǔ)充)3.DNA接頭（adaptor）連接法

問(wèn)：銜接物和DNA接頭有什么區(qū)別？？？銜接物（linker）是一種人工合成的雙鏈DNA短片段，其上具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在將與其連接的載體DNA上不存在的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可按平齊末端連接法給平齊末端片段加上相同識(shí)別位點(diǎn)的銜接物，再用在銜接物中具有識(shí)別位點(diǎn)的合適限制酶切割，用常規(guī)方法連接的方法，提高平齊末端間的連接作用效率。也可利用接頭進(jìn)行DNA平齊末端門(mén)的連接。接頭（adaptor）是一種具有粘性末端的短核苷酸雙鏈，它與平齊末端連接后，不用經(jīng)過(guò)切割即可與載體相連。第59頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶

3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率

持續(xù)能力

大腸桿菌DNA聚合酶

低

有

中

低

Klenowfragment

低

無(wú)

中

低

T4DNA聚合酶

高

無(wú)

中

低

T7DNA聚合酶

高

無(wú)

快

高

化學(xué)修飾T7DNA聚合酶

低

無(wú)

快

高

遺傳修飾T7DNA聚合酶

無(wú)

無(wú)

快

高

逆轉(zhuǎn)錄酶

無(wú)

無(wú)

低

中

TaqDNA聚合酶

無(wú)

有

快

高

DNA聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，將脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分為：依賴(lài)于DNA的DNA聚合酶和依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶。第60頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。第61頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′2.5’→3’外切酶活性3.3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的三種活性第62頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I用途：

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無(wú)dNTP時(shí)）

2）補(bǔ)齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA其中用途2)和3)常用大片段第63頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（一）基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。

Klenow片段仍擁有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。

第64頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（二）用途

1.3’端補(bǔ)平：補(bǔ)平限制性?xún)?nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。

2.DNA3’末端標(biāo)記:在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。5’klenow

klenow

5’

第65頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（二）用途

3.cDNA第二鏈的合成

mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow

5’3’3’

5’

5’3’

引物

第66頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶三、T4噬菌體DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解單鏈更快）

。

在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3`-OH端外切在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位

第67頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶三、T4噬菌體DNA聚合酶（二）用途第68頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶四、T7噬菌體DNA聚合酶與測(cè)序酶

（一）T7噬菌體DNA聚合酶從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成，已知DNA聚合酶中持續(xù)結(jié)合能力最強(qiáng)的一個(gè)。

（二）T7噬菌體DNA測(cè)序酶通過(guò)對(duì)T7DNA聚合酶進(jìn)行化學(xué)修飾，去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

第69頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、TaqDNA聚合酶

來(lái)源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種。

結(jié)構(gòu)：?jiǎn)蝸喕鵐W=94000d。

特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性，70℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性為原來(lái)的40%。活性：聚合最適溫度為75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性。用途：

1.PCR反應(yīng)。

2.測(cè)序，高溫下進(jìn)行DNA合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。第70頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶三、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。

來(lái)源商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來(lái)自禽類(lèi)成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)(42℃)。來(lái)自能表達(dá)Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的E.coli(37℃)。

結(jié)構(gòu)和活性：酶類(lèi)別肽鏈5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000++++M-MLV84，000++第71頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

用途：

(1)5’

→3’

聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子；

(2)RNA酶H活性：對(duì)RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板的步驟。

(3)用于３’凹陷末端的標(biāo)記，雜交探針的制備和DNA序列測(cè)定。第72頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

RNaseH活性第73頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶來(lái)源及特點(diǎn)：

簡(jiǎn)稱(chēng)末端轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’→3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線(xiàn)性DNA分子的3’-OH末端。

它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA。用途：

1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’

末端。

2.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：

生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。

3.用于在平頭DNA上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。第74頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)DNA修飾酶第75頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月末端轉(zhuǎn)移酶功能圖解第四節(jié)DNA修飾酶3‘突出末端第76頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、T4噬菌體多核苷酸激酶來(lái)源從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。功能

催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。

不論5’-OH端突出與否。

用途：DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶第四節(jié)DNA修飾酶第77頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、堿性磷酸酶

1）堿性磷酸酶種類(lèi)

細(xì)菌性堿性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase，BAP），從大腸桿菌中分離出來(lái)。具有抗熱性。

小牛腸堿性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase，CIAP），從小牛腸中純化出來(lái)。加熱68℃可完全失活。

2）堿性磷酸酶的特性

催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

3’HO-

-P

5’

3’HO-

-OH

5’3’HO-

-OH

堿性磷酸酶

5’P-

-OH

3’5’

第四節(jié)DNA修飾酶第78頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)DNA修飾酶第79頁(yè)，課件共92頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3)堿性磷酸酶的功能

防止線(xiàn)性化的載體份子自我連接

其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。第四節(jié)DN