實(shí)驗(yàn)六家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)

實(shí)驗(yàn)六家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)血凝和血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutination

and

Hemagglutination

InhibitionAssay,

HA

and

HI）家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)

臨床癥狀和病理變化只能作為疾病診斷的一個(gè)指征，不能作為確診的依據(jù)。病原檢測抗體檢測分子診斷鑒別診斷病毒分離鑒定病毒的分離鑒定：是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。樣品采集培養(yǎng)系統(tǒng)分離方法病毒鑒定傳代細(xì)胞原代細(xì)胞雞胚糞便、腸內(nèi)容物泄殖腔、氣管拭子病變組織接胚離心取上清勻漿或懸浮生物學(xué)特征致病性試驗(yàn)血凝試驗(yàn)單抗分群

接種途徑1、絨毛尿囊膜接種（法氏囊、傳喉）2、尿囊腔接種（禽流感、新城疫、傳支）（鴨胚或鵝胚尿囊腔：鴨肝炎、鴨瘟、EDS-76）3、卵黃囊接種（法氏囊、EDS-76）4、羊膜腔接種 正粘病毒和副粘病毒（流感、腮腺炎等病毒）

尿囊腔接種主要用于正粘V和副粘V，如流感V、新城疫V的分離和增殖。1、選用9-11日齡的雞胚，畫出氣室和胚位2、在氣室接近胚體處用碘酊和酒精進(jìn)行消毒3、用打孔器穿一小孔，將注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接種物4、用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并檢卵一次，24h內(nèi)死亡者廢棄。絨毛尿囊膜接種主要用于痘V和皰疹V的分離和增殖。1）取10-12日齡雞胚，畫出氣室部，消毒2）在氣室端的卵殼上開一1.5×1.5cm的口3）用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜4）滴入接種物5）用膠布或透明膠紙封閉切口

收毒收毒前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時(shí)以上，凍死胚胎，防止出血。根據(jù)接種途徑的不同，收獲相應(yīng)的材料1、絨毛尿囊膜接種 收獲接種部位絨毛尿囊膜2、尿囊腔接種 收獲尿囊液（5-8ml）3、卵黃囊接種 收獲卵黃囊或胚體4、羊膜腔接種 收獲羊水（0.5-1ml）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康难脱种圃囼?yàn)的原理。實(shí)驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定。了解HA和HI實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用（定性，定量）。能凝集紅細(xì)胞的禽的病原禽流感病毒新城疫病毒傳染性支氣管炎病毒（胰酶，磷脂酶C）EDS76副雞嗜血桿菌雞毒支原體二、實(shí)驗(yàn)原理（一）血凝試驗(yàn)（HA）一些病毒能夠促使動(dòng)物如雞、鵝、豚鼠和人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，叫做血凝試驗(yàn)。HA的原理圖++++++++++-血凝試驗(yàn)結(jié)果判定1:21

1:22

1:23

1:24

1:25

1:26

1:

271:28

1:29

1:210

1:211

1:212血凝價(jià)：能使紅細(xì)胞產(chǎn)生50%凝集的病毒最高稀釋度。（一個(gè)血凝單位）VaVbVcVd（二）血凝抑制試驗(yàn)（HI）當(dāng)病毒懸液中加入特異性抗體時(shí)，這種紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象就被抑制，稱紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，即血凝抑制試驗(yàn)。HI的原理圖三、實(shí)驗(yàn)材料雞新城疫病毒：雞新城疫弱毒株（Lasota）接種雞胚、收獲尿囊液制備。雞紅細(xì)胞：采集健康雞血液，以阿氏液抗凝，以生理鹽水洗滌3~5次，將血漿、白細(xì)胞等充分洗去，用生理鹽水配置成1%紅細(xì)胞懸液使用。0.85%生理鹽水。被檢血清，采自被檢雞的健康血清。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）血凝試驗(yàn)（HA）1~12孔加入50μl生理鹽水;第1孔加50μl病毒懸液，倍比稀釋到第10孔；1~12孔中加入1%的紅細(xì)胞50μl；震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。病毒液的血凝價(jià)是1:2？?？滋?/p>

1稀釋倍數(shù)

1:212

3

4

5

6

7

8

9

10

RBC1:22

1:23

1:24

1:25

1:26

1:27

1:28

1:291:210生理鹽水

5050505050

5050505050

50病毒懸液

50/1%紅細(xì)胞

5050

50

50

50

50

50

50

50

5050

50

50

50

50

50

50

50

50

50棄50μl血凝試驗(yàn)（HA）震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。Agglutination

patterns

observed

with

HAI

plate

tilted

at

a60°

angle.Diana

L.

Noah

et

al.

Clin.

Vaccine

Immunol.

2009;16:558-566（二）血凝抑制試驗(yàn)（HI）1~11孔加入25μl生理鹽水;第1孔加待檢血清25μl，倍比稀釋至第10孔;1~11孔加25μl

4個(gè)血凝單位的病毒懸液;1~12孔中每孔加入1%的紅細(xì)胞50μl;震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果;紅細(xì)胞凝集100%的抑制作為結(jié)果判定的終點(diǎn)。如果血凝價(jià)為1:28

（256個(gè)單位），那么4個(gè)血凝單位就是將病毒液進(jìn)行26倍（64倍）稀釋10/640=

1/26,所以病毒原液取10μl，生理鹽水取630μl；4個(gè)血凝單位病毒懸液體積：25μl/孔×12孔=400μl?？滋?/p>

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Virus

血清稀釋倍數(shù)

1:21

1:22

1:23

1:24

1:25

1:26

1:27

1:28

1:29

1:210生理鹽水25

25

25

25

25

25

25

25

25

2525

25被檢血清25

25

25

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25

25

25

25

25

25/病毒懸液25

25

25

25

25

25

25

25

25

251%RBC50

50

50

50

50

50

50

50

50

502525

/50

50棄25μl血凝抑制試驗(yàn)（HI）震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定血清對照孔：RBC沉于孔底，無自凝病毒對照孔：凝集RBC對照孔：無自凝