聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳第1頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月1、作用

分離蛋白質(zhì)、核酸2、概念聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好、有彈性、透明、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對pH和溫度變化小、沒有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。

第2頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）3、原理第3頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式第4頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）亞甲雙丙烯酰胺第5頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月PAGE的聚合需要催化劑——氧化還原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進(jìn)行聚合。（1）化學(xué)聚合：AP-TEMED系統(tǒng)過硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合形成凝膠。TEMED的游離堿基能促進(jìn)AP的形成SO42-。第7頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合

分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧

升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合第8頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)核黃素（riboflavin）在光照下（可見光或紫外光）分解，其黃素部分被還原成無色型，但在有氧條件下無色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝膠。注意：分離膠的合成一般采用化學(xué)聚合。因?yàn)槿粲霉饩酆?，凝膠的孔徑受光照強(qiáng)度與時(shí)間的影響，導(dǎo)致孔徑大小不同，從而影響蛋白質(zhì)的分離。第9頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）（根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、形狀、電荷來分離蛋白質(zhì)）（根據(jù)亞基分子量分離蛋白質(zhì)）第10頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳第11頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

概述1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。

他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑（SDS）以后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。第12頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理1.蛋白質(zhì)分子的解聚(1)SDS（十二烷基硫酸鈉，sodiumdodecylsulfate,SDS)陰離子去污劑變性劑助溶性試劑斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵分子去折疊破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)第13頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)強(qiáng)還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。第14頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)原理第15頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月--------------------------------------第17頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚成組成它們的多肽鏈（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束；蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷達(dá)到超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。第18頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）形狀像一個(gè)長橢圓棒（2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。第19頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2.凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。蛋白質(zhì)的分子量在15-200kD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，因此SDS不僅可以分離鑒定蛋白質(zhì)，還可以根據(jù)遷移率的大小測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。第20頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月PAGE的濃度與孔徑的關(guān)系PAGE孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：20~40完全透明且有彈性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊狀不成形，易破碎。第21頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠總濃度T——100ml凝膠溶液中含有Acr和Bis的總克數(shù)。T=（a+b）/m×100%T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）×100%當(dāng)T固定時(shí)，Bis濃度在5%時(shí)孔徑最小。第22頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月3、分類按具體操作分垂直板形電泳圓盤電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分連續(xù)PAGE

不連續(xù)PAGE

第23頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳體系中所用的緩沖液成分、pH、凝膠濃度相同緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度呈不連續(xù)性不連續(xù)的凝膠電泳體系對樣品的分離效果好，分辨率高，是最常用的體系。電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)：不連續(xù)性所致連續(xù)電泳不連續(xù)電泳PAGE電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)第24頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月不連續(xù)SDS1.原理凝膠的不連續(xù)性緩沖離子的不連續(xù)性pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性分離膠pH8.9濃縮膠pH6.7第25頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

①

凝膠的不連續(xù)性：

濃縮膠：大孔徑。樣品在其中濃縮，并按遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。分離膠：小孔徑。蛋白質(zhì)分子在大孔膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快，進(jìn)入小孔膠時(shí)遇到的阻力大，遷移速度減慢。由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔膠和小孔膠界面處就會使樣品濃縮，取帶變窄。第26頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月②緩沖離子的不連續(xù)性

③pH的不連續(xù)性④電位梯度的不連續(xù)性制膠緩沖液：Tris-HCl

濃縮膠pH6.7分離膠pH8.9電泳緩沖液：Tris-甘氨酸在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，甘氨酸解離少，在電場作用下泳動(dòng)效率低，而Cl—卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子介于二者之間泳動(dòng)。第27頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。

樣品進(jìn)入分離膠（pH8.9）后，由于膠中pH的增加，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨Cl-之后，樣品不再受離子界面的影響。第28頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)過程凝膠制備樣品處理與加樣電泳剝膠與固定染色與脫色安裝電泳槽第30頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟一、制膠

1.配膠

配膠應(yīng)根據(jù)所測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS有連續(xù)體系和不連續(xù)體系兩種，兩者各有不同緩沖體系，因而有不同的配制方法。（以不連續(xù)體系為例）蛋白質(zhì)的相對分子量的范圍分離膠的濃度＜10420%～30%1×104～4×10415%～20%4×104～1×10510%～15%1×105～5×1055%～10%＞5×1052%～5%第31頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分離膠緩沖液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-濃縮膠貯液（10%Acr-0.5%Bis）----3.0濃縮膠緩沖液（pH6.8Tris-HCl）----1.2510%SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸餾水11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%AP0.100.100.100.100.05第32頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月2.分離膠的制備

膠灌至距梳子齒下端1cm→灌畢→封上一層水加速聚合→當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。3.濃縮膠的制備

用濾紙吸干水→倒入濃縮膠→插入梳子→靜置，聚合。第33頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月二、樣品處理與加樣

1.樣品處理

2.加樣

小心拔出梳子上下槽注入電極緩沖液用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣三、電泳接上電泳儀，上槽為負(fù)極，下槽為正極。打開開關(guān)，保持恒壓進(jìn)行電泳。

樣品溶解沸水浴冷卻加樣樣品遷移方向樣品溶解液第34頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。

不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動(dòng)示意圖混合樣品帶孔膠

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子第35頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月流程圖第36頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果分析1.相對遷移率的計(jì)算

相對遷移率mR=蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-凝膠上的示意圖第37頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以每條Marker帶的相對遷移率為橫坐標(biāo)，相應(yīng)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖

分子量相對遷移率第38頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月3.未知蛋白質(zhì)樣品分子量的測算

計(jì)算未知蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對應(yīng)的縱坐標(biāo)，即可得該樣品的分子量。如圖第39頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白

相對遷移率SDS測定蛋白質(zhì)分子量示意圖第40頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項(xiàng)1.SDS的純度：市售SDS(A.R.)需重結(jié)晶后再用。2.SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量：大多數(shù)1.4gSDS/g蛋白質(zhì)

影響蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合的因素主要有以下3個(gè)：(1)溶液中SDS單體的濃度

(2)樣品緩沖液的離子強(qiáng)度(3)二硫鍵是否完全被還原3.凝膠濃度：應(yīng)根據(jù)位置樣品估計(jì)相對分子質(zhì)量，選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度。測定蛋白質(zhì)相對分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲