測序質(zhì)量判斷和測序常見問題

測序質(zhì)量判斷和測序常見問題DNA測序原理目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert（1977）發(fā)明的化學降解法。Sanger法測序的原理Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它播們魚具夢有腔共閥同全的柏起宿始箱點良，氣但糖終望止腥在作不郊同道的睛的賴核哀苷絡酸敏上襖，丘可北通融過科高覺分漂辨淹率離變貸性屬凝攏膠占電跌泳擾分掃離煙大痰小登不至同信的斤片生段攤，縮慧凝笑膠伶處譯理療后據(jù)可返用匪X鼠-杜光裙膠鐵片慚放屋射弱自榴顯篩影投或涉非宮同達位弦素筋標咸記池進累行聲檢薯測袍。自礙動總化痛測社序首升先女，笛通乓過競對攜d址d偵N螞T中P劃進腹行樣不順同語的抵熒項光撕標泡記屈實扭現(xiàn)翁在邀一嗚個湯泳寸道扇實曲現(xiàn)飼四擾種烈堿屠基膚判粥讀喂。后詠來呈，哪各絨公椅司允有膜改妻進創(chuàng)了哈電朵泳們方耽法遭，飼將閣毛呀細朵管雷電咳泳泳技錫術考引訂入紛了廉測約序仇儀傅，積大駛大霜提敲高蓄了栽分創(chuàng)辨盈率嫌。湯（晉排傭除銜了鵝橫惠向龜擴窮散貌和奧泳陸道樹間垂的過干撈擾針）影杜響蠟測哄序網(wǎng)結(jié)雜果紡的梁因款素測序反應反應組分模版引物其他標準試劑污染組分反應條件體積退火溫度退火時間產(chǎn)物純化樣品純度（空氣，鹽離子，染料，乙醇）電泳分離上樣量電泳條件檢測熒光激發(fā)和接受的靈敏度常鍵見寇問聚題反伴應咳整線體側(cè)差釘，坊雜木峰蜜很螺多者，悅序儲列運完塞全消比具不查上序狼列臨能暖比造上彼，劫但豪很晚多謊地抄方楚有堂“孤突啞變糾”用，平有津“只插買入梢”夠，償有疏“刻缺營失湖”測教序狗長止度帥太騎短榴了常翻見頌問笑題急的秒原咱因反錘應餡整麥體摟差嘴，爭雜昨峰招很并多姑，壺序訓列壟完緩全麥比歲不揪上根藥本塵沒宇反駁應戶，帝引片物銳和般模麻版錯不飛匹癢配序狗列雪能愈比祥上猶，怨但矮很鼓多怕地腰方跌有箏“叨突煙變攻”既，正有性“威插盲入淚”鐘，嚴有涂“偏缺罰失京”咐，撇測車序躬長原度蒸太逮短牲了有挎反頌應系，付但鋪質(zhì)截量吩差分手析這一五下畏原掀因咐可稿幫呆助鞠大溉家傻卻移認黨測榮序裁結(jié)存果況，如確豈定此是愚否雹需粱要航重棋新濤測側(cè)序柿。分待析饑時怖應棒從殖大波到潑小汗，咸從敏整耳體鐵入肅手整體比對反應整體形狀具體位置原因有強平均峰寬，峰形向前拖引物降解向后拖樣品降解頭大腳小反應前部較好但很短，看峰形是個“大頭娃娃”引物過多信號突然衰減或消失Poly結(jié)構互補結(jié)構個別位置問題70-80，100-120有C或T峰染料峰200,400有G峰乙醇峰50bp之前信號雜亂，有高峰引物二聚體個別堿基不匹配前后反應信號良好突變反應過程中突然有高峰位置不定氣泡弱模版量引物引發(fā)效率無有反應信號多模版多結(jié)合位點反應信號相