凝膠內(nèi)沉淀試驗p教材課件

凝膠內(nèi)沉淀試驗單向擴(kuò)散試驗沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)液體內(nèi)沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗雙向擴(kuò)散試驗單向擴(kuò)散試驗

液相內(nèi)沉淀試驗

一、絮狀沉淀試驗二、免疫濁度試驗

要掌握哦！凝膠內(nèi)沉淀試驗

該試驗利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。

最常用的凝膠為瓊脂糖。適宜濃度的凝膠可視為一種固相的液體，水分占98％以上，凝膠形成網(wǎng)絡(luò)，將水分固相化?？乖涂贵w蛋白質(zhì)在此凝膠內(nèi)擴(kuò)散，猶如在液體中自由運動。由于瓊脂網(wǎng)孔有一定的限度，抗原抗體結(jié)合后，這種超大分子則被網(wǎng)絡(luò)在瓊脂中，形成沉淀。凝膠內(nèi)沉淀試驗可根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的方式和特性，分為單向擴(kuò)散試驗和雙向擴(kuò)散試驗。雙向擴(kuò)散試驗

在瓊脂內(nèi)抗原和抗體自由擴(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線。單向擴(kuò)散試驗

本試驗是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。

平板法

將抗體或抗血清混入1.5％瓊脂內(nèi)（約50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37℃讓其向四周擴(kuò)散，24～48h后可見周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。最后，測量沉淀環(huán)的直徑。在檢測標(biāo)本的同時，用已知含量的標(biāo)準(zhǔn)抗原作4～7個稀釋度，同時測量圈的大小。取對數(shù)紙做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。抗原含量與環(huán)徑的關(guān)系有兩種計算方法：

1.Fahey曲線：這種曲線適用于小分子抗原和較短時間（24h）擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)劃線，濃度的對數(shù)與擴(kuò)散圈直徑之間呈線性關(guān)系。用公式表示：logC/d＝K式中C＝抗原濃度d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)。圖Fahey曲線t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上可見t1為直線，t3為拋物線沉淀環(huán)直徑與抗原量相關(guān)，不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系。

2．Mancini曲線適用于大分子抗原和長時間擴(kuò)散（＞48h）的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系（圖12-3）。利用公式表示：C/d2＝K圖Mancini曲線

T1為16-24h；T2為24～48h；T3為48h以上；可見T3為直線，T1為反拋物線單向免疫擴(kuò)散抗體+瓊脂沉淀環(huán)上排為5個不同的參考

中、下排為患者血清

下排右2為一異常病理血清實驗：單向瓊脂擴(kuò)散試驗

實驗原理：將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴(kuò)散的過程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處出現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與孔中的抗原濃度相關(guān)，可從已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測標(biāo)本中抗原的含量。要掌握哦！各種蛋白質(zhì)只要符合以下3條，幾乎皆可用SRID定量測定：①備有僅對某待測抗原的單價特異抗血清；②備有已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品；③待測品含量在1.25μg/ml以上（單向擴(kuò)散技術(shù)的敏感度）?，F(xiàn)在最常用于臨床檢測的項目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白操作方法：

一、瓊脂凝膠準(zhǔn)備：1.5%（15g/L）的瓊脂凝膠水浴中煮沸置56℃水浴中備用抗IgG血清１ml+59ml瓊脂凝膠，置56℃?zhèn)溆谩６?、制?取潔凈干燥玻片，置于水平臺上。吸取瓊脂液5ml澆于載玻片上，置室溫冷卻凝固。三、打孔：待瓊脂凝固后，用打孔器打孔。

四、加樣：將待檢血清１：14稀釋(100ul血清+生理鹽水1400ul)，取稀釋血清10ul加入相應(yīng)的試驗孔中.

同時另入不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品10ul(0.4g/l0.6g/l0.8g/l1.0g/l)

五、擴(kuò)散：將加樣的瓊脂凝膠板平放于濕盒內(nèi)，置37℃24h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷精確測量各試驗孔沉淀環(huán)的直徑，以各稀釋度工作標(biāo)準(zhǔn)的沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得待檢血清相應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實際含量。(抗原濃度)0

102550100(直徑)

Fehcy曲線

適用于小分子量抗原和長時間擴(kuò)散（24小時）實驗討論

注意事項：1）澆制瓊脂板時，抗血清與瓊脂要充分混勻，澆板要均勻、平整、薄厚一致，無氣泡，布滿整張玻片。2）加樣孔打得圓整光滑，邊緣不要破裂，底部勿與載玻片脫離。3）抗血清與溶化瓊脂混合時，一定要把溶化瓊脂的溫度控制在56℃條件下，如過高會使抗體變性，過低則瓊脂凝固不能澆板或澆板不均勻，不平整。4）抗血清、待檢標(biāo)本、參考血清的稀釋及加樣要準(zhǔn)確。沉淀環(huán)測量必須準(zhǔn)確，若有誤差，當(dāng)乘以稀釋倍數(shù)后會成幾十倍增長。5）每批實驗均應(yīng)同步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。決不可一次做成，長期應(yīng)用。6）擴(kuò)散時瓊脂板應(yīng)保持水平，以免沉淀環(huán)變形，影響結(jié)果判定。方法評價免疫球蛋白定量測定較常用的方法有單向擴(kuò)散法與免疫濁度法，前者較為簡便，后者更為準(zhǔn)確迅速，免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應(yīng)達(dá)到快速、微量、自動化的新階段。免疫球蛋白

免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)一、基本結(jié)構(gòu)：四肽鏈結(jié)構(gòu)

由兩條相同的輕鏈（LightChain）和兩條相同的重鏈（Heavychain）通過鏈間二硫鍵連結(jié)形成。

分子式為：H2L2四條肽鏈兩端游離的NH2和COOH方向一致分別命名為N端和C端（一）輕鏈和重鏈輕鏈（L鏈）

κ鏈λ鏈輕鏈決定型別κ型λ型正常人κ：λ≈2：1重鏈（H鏈）:根據(jù)其抗原性的差異，人類Ig的H鏈分為

鏈鏈鏈鏈鏈重鏈決定Ig類別

IgG

IgA

IgM

IgD

IgEIgG的特性與功能1、由淋巴結(jié)和脾臟的漿細(xì)胞產(chǎn)生。2、在血清中含量最高，占血清Ig總量的75-80%。3、是血液循環(huán)中主要的防御性抗體，能激活補(bǔ)體、中和病毒、中和毒素、調(diào)理吞噬。4、能通過胎盤，對新生兒抗感染起重要作用。5、再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生IgG，為高親和力抗體。6、可與葡萄球菌蛋白A（SPA）結(jié)合，用于免疫診斷。臨床意義

1.血清多克隆Ig