分子生物學課件第七章-蛋白質的生物合成-翻譯

第七章蛋白質的生物合成－翻譯Chapter7proteinbiosynthesis（translation）7/20/20231一、遺傳密碼（geneticcodon）mRNA上存在遺傳密碼

遺傳密碼:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與蛋白質中氨基酸序列之間的對應關系稱為遺傳密碼。

密碼子(codon)：mRNA上每3個相鄰的核苷酸編碼蛋白質多肽鏈中的一個氨基酸，這三個核苷酸就稱為一個密碼子或三聯(lián)體密碼（tripletcodon）7/20/20232

1954，Gamov

提出三聯(lián)體密碼子1、遺傳密碼的證實

1961年Crick等證實了三聯(lián)密碼的真實性

Nirenberg以均聚物及核糖體結合實驗破譯遺傳密碼

Khorana特定共聚物遺傳密碼

1966，64種密碼子全部測完7/20/20233缺失或插入核苷酸引起三聯(lián)體密碼的改變CATCATCATCATCATCATCATCACATCATCATCATCCATCACAXTCATCATCAT

CAXTXCATX

CATCATCAT-1-1,+1+37/20/20234無細胞系統(tǒng)的建立:1961年Nirenberg建立了無細胞系統(tǒng)這一新技術又是在多核苷酸磷酸化酶發(fā)現(xiàn)的基礎上建立起來的。1955S.Ocha在細菌中分離了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）,它催化核糖核苷二磷酸的聚合，它不需要任何DNA模板就可合成.7/20/20235他們的方法是:(1)去模板：用DNAase處理E.coli抽提物，使DNA降解，除去原有的細菌模板。

(2)加入polU：合成了多聚苯丙氨酸這一結果不僅證實了無細胞系統(tǒng)的成功，同時還表明UUU是苯丙氨酸的密碼子。分別加入polyA，polyC和polyG結果相應地獲得了多聚賴氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。7/20/20236

(3)按比例加入２種核苷混合的多聚物由于當時還未分離RNApol酶，無法按設計的模板來合成RNA，Nirenberg又想出了一種新的方法，就是按一定的堿基比例來合成RNA。比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，堿基比為U：G＝5：1，它們能組成8種三聯(lián)體：

UUU，UUG，UGU，GUU，

GGG，GGU，GUG，UGG。U和G隨機加入到三聯(lián)體中，這樣按比例各個位置上進入U和G的概率不同，如氨基酸測定結果：7/20/20237如UUU：UGG＝（555）:（511）＝25：1同理UUU：UUG＝5：1，根據(jù)檢測結果推測:苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）＝

5：1苯丙氨酸（UUU）：纈氨酸（GUU）

＝5：1苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GGU）

＝24：17/20/20238核糖體結合實驗1964年Nirenberg又采用核糖體結合實驗(1)tRNA和氨基酸及三聯(lián)體的結合是特異的；(2)上述結合的復合體大分子是不能通過硝酸纖維濾膜的微孔，而tRNA-氨基酸的復合體是可以通過的。7/20/202397/20/202310以特定的共聚物為模板指導多肽的合成Khorara采用了有機合成一條短的單鏈DNA重復序列然后用DNApol合成其互補鏈，再用RNApol及不同的底物合成兩條重復的RNA共聚物，作為翻譯的mRNA，加入到體外表達系統(tǒng)中7/20/2023117/20/202312Ser絲氨酸;Thr蘇氨酸;Tyr酪氨酸;Phe苯丙氨酸7/20/202313起始密碼(initiationcodon):AUG

終止密碼(terminationcodon):UAA，UAG，UGA共６４個，其中６１個為有意義密碼（20種氨基酸？）開放讀碼框：從mRNA5’端起始密碼子AUG到3’端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質多肽鏈，稱為開放讀碼框（openreadingframe,ORF）。7/20/202314遺傳密碼表7/20/2023152、遺傳密碼的基本特征（1）連續(xù)性編碼蛋白質氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。如插入或缺失一堿基，可造成移碼突變。Thr蘇氨酸;Tyr酪氨酸7/20/202316（2）密碼子的簡并性同一個氨基酸具有兩個或更多個密碼子的現(xiàn)象稱密碼子的簡并性（degeneracy）。對應于同一種氨基酸的不同密碼子稱同義密碼子（synonymouscodon）大多數(shù)簡并性表現(xiàn)在密碼子的第三個核苷酸上，即第一、二個核苷酸確定后，第三個核苷酸可變。7/20/202317氨基酸密碼子的簡并性簡并密碼子越多，生物遺傳的穩(wěn)定性越大，氨基酸出現(xiàn)頻率越高意義：色氨酸7/20/202318（3）擺動性（wobble）AUC

123擺動配對轉運氨基酸的tRNA的反密碼需要通過堿基互補與mRNA上的遺傳密碼反向配對結合，但反密碼與密碼間不嚴格遵守常見的堿基配對規(guī)律，稱為擺動配對。三中讀二（2outof3reading）7/20/202319密碼子、反密碼子配對的擺動現(xiàn)象tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U,C,AA,GU,CUG7/20/202320三中讀二一般可分為三種情況：(1)第１,２兩個堿基形成６個氫鍵時，可三中讀二。如CCX，CGＸ，GCX和GGX。(2)第1,2兩個堿基形成4個氫鍵時,不可三中讀二。如AAX，AUX，UAX和UUX。(3)第1,２兩個堿基形成５個氫鍵時,

當?shù)诙€堿基為嘧啶時，可三中讀二；如UCX，ACX，CUX和GUX。當?shù)诙€堿基為嘌呤時則不能三中讀二，如CAX，GAX，UGX和AGX。7/20/202321密碼子的使用頻率與tRNA的數(shù)量有關（4）密碼子的偏愛性（codonusagebias）如：Leu有6種不同密碼子，但CUG使用很高，而CUA使用率就很低。同一物種中，編碼同一氨基酸的密碼子的使用頻率不同。不同物種間（原核和真核生物），編碼同一氨基酸的密碼子的使用頻率也不同。需要量多的蛋白質有關codonusage高相應tRNA量多7/20/202322CodonusageObservedforE.coliRibosomeProteincodons7/20/202323CodonusageinthegenesofAnimalscodons7/20/202324（5）通用性和變異性蛋白質生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。動物細胞的線粒體DNA（mtDNA）、支原體及少數(shù)纖毛類原生動物的編碼方式與通用密碼子有所不同。7/20/202325CodonUsualmeaningAlternativeOrganelleororganismAGAAGGArgStop,SerSomeanimalmitochondriaAUAIleMetMitochondriaCGGArgTrpPlantmitochondriaCUNLeuThrYeastmitochondriaAUUGUGUUGIleValLeu

StartSomeprotozoansUAAUAGStopGluSomeprotozoansUGAStopTrpMitochondria,mycoplasma線粒體密碼子的特殊性7/20/202326二、

tRNA1.tRNA的結構50~95nt組成，其中22nt是恒定的，呈三葉草結構;5’端和3’端配對（常為7bp）形成莖區(qū)，稱為受體臂（acceptorarm）或稱氨基酸臂。在3’端永遠是4個堿基（XCCA）的單鏈區(qū)，在其末端有2’-OH或3’-OH，是被氨基酰化位點,此臂負責攜帶特異的氨基酸。7/20/202327TψC常由5bp的莖和7nt的環(huán)組成，此臂負責和核糖體上的rRNA識別結合；反密碼子環(huán)(anticodonloop)常由5bp的莖區(qū)和7Nt的環(huán)區(qū)組成，它負責對密碼子的識別與配對。D環(huán)(Dloop)的莖區(qū)長度常為4bp，也稱雙氫尿嘧啶環(huán)。負責和氨基酰tRNA聚合酶結合;額外環(huán)(extraloop)可變性大，從4Nt到21Nt不等，其功能是在tRNA的L型三維結構中負責連接兩個區(qū)域（D環(huán)－反密碼子環(huán)和TψC-受體臂）。7/20/202328---aaacceptarm;loadingaaat3’end---DHUloop;

contactwithAARS---anti-codonloop;

34thiswobblebase---TΨCloop;

contactwith5srRNA---extraloop;

347/20/202329tRNA的三級結構示意圖(倒L形)7/20/2023302、氨基酸活化（1）

氨基酰-tRNA分子的形成氨基酸的活化氨基酸+ATP+tRNA氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA+AMP+PPi7/20/202331（2）氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA

synthetase，AARS)存在于胞液中，催化一個特定的aa結合到相應的tRNA分子上。

每種氨基酰tRNA合成酶對相應氨基酸以及攜帶氨基酸的數(shù)種tRNA具有高度特異性，保證tRNA能夠攜帶正確的氨基酸對號入座。7/20/202332（3）氨酰tRNA合成酶的鑒別功能動力學校對（Kineticproofreading）化學校對（Chemicalproofreading）7/20/202333以aa為準校正tRNA7/20/202334以tRNA為準校正aa7/20/202335

原核和真核生物核糖體的組成及功能核糖體亞基rRNAs

蛋白

RNA的特異順序和功能

細菌

70S

50S23S=2904b31種(L1-L31）含CGAAC和GTψCG互補2.5×106D5S=120b66%RNA30S16S=1542b21種(S1-S21)16SRNA(CCUCCU)和S-D

順序(AGGAGG)互補

哺乳動物

80S

60S28S=4718b49種有GAUC和tRNAfMet的TψCG互補4.2×106D5S=120b60%RNA5.8S=160b

40S18S=1874b33種和Capm7G結合

三、核糖體的結構和功能7/20/202336核糖體的組成7/20/202337mRNA結合位點：與mRNA結合，位于30S亞基上P位：即肽位(peptidylsite)，或給位，在延長成肽之后，3′端連接肽鏈的肽酰tRNA占據(jù)的位置，肽鏈轉位至此，延長繼續(xù)。A位：即氨基酰位(aminoacylsite)，或稱受位，每次延長，氨基酰tRNA就加入到A位上，延長成肽中，此位因接受肽?；湥拭芪?。E位：排出位(exitsite)，空載的tRNA從此位點被排出活性位點7/20/2023387/20/202339原核生物翻譯過程中核蛋白體結構模式:A位：氨基酰位(aminoacylsite)P位：肽酰位(peptidylsite)E位：排出位(exitsite)7/20/202340蛋白質生物合成體系n氨基酸蛋白質mRNA、tRNA、rRNA酶、蛋白質因子、ATP、GTP7/20/202341四、蛋白質的翻譯過程肽鏈合成的方向：氨基端（N端）羧基端(C端)由多種蛋白因子和RNA分子參與包括氨酰－tRNA復合物的形成，翻譯的起始，延伸和終止過程7/20/2023421、氨酰－tRNA復合物的形成氨基酸+tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase)7/20/202343◆氨基酰-tRNA的表示方法：

Ala-tRNAAla

Ser-tRNASerMet-tRNAMet◆起始肽鏈合成的氨基酰-tRNA

真核生物：Met-tRNAiMet

原核生物：fMet-tRNAifMet7/20/2023442、翻譯的起始肽鏈合成起始階段，是指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核糖體結合而形成翻譯起始復合物的過程。需要起始因子（IF或eIF）和ATP、GTP參與。

翻譯的起始是mRNA能忠實翻譯的關鍵步驟，也是調節(jié)蛋白質合成的部位。7/20/2023451.核糖體大、小亞基分離;2.mRNA在小亞基定位結合；

S-D序列：又稱核糖體結合位點(ribosomalbindingsite,RBS)，是mRNA起始密碼上游的一段富含嘌呤核苷酸的序列，該序列以…AGGA…為核心。

IF1、IF3協(xié)助3.起始氨基酰-tRNA（fMet-tRNAifMet

）在小亞基上就位；4.核糖體大亞基結合。（1）原核生物翻譯的起始7/20/202346小亞基與mRNA的結合S-D序列5’3’小亞基7/20/20234730S起動復合物的形成30S小亞基30S小亞基+IF1+IF3IF1+IF330S小亞基＋mRNA+IF1+IF3mRNA30S小亞基+mRNA+IF1+IF2+IF3+GTP+甲酰蛋氨酰tRNAIF2+GTPAUG5'3'IF-3IF-1IF-2GTP甲酰蛋氨酰tRNA30S啟動復合體7/20/202348三種起始因子IF1IF2

IF3功能輔助IF3結合30S小亞基，占據(jù)A位點特異識別fmet-tRNAifmet形成fmet-tRNAifmet

-IF2-GTP有GTP酶活性結合30S小亞基使核糖體解離促進30S小亞基與mRNA結合7/20/20234930S啟動復合體30S小亞基+mRNA+IF1+IF2+GTP+甲酰蛋氨酰tRNAIF330S小亞基+mRNA+50S大亞基+IF1+IF2+GTP+甲酰蛋氨酰tRNA50S大亞基30S小亞基+mRNA+50S大亞基+甲酰蛋氨酰tRNAGDP+PiGTPIF1+IF2IF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPGDPPi70S起動復合體的形成70S啟動前復合體啟動復合體7/20/202350起始和延伸Met-tRNAs的區(qū)別：⑴兩種tRNA本身有差別；⑵氨基酸的狀態(tài)不同。7/20/2023517/20/2023527/20/202353（2）真核生物蛋白質合成的起始7/20/2023547/20/2023557/20/2023567/20/202357◆根據(jù)mRNA密碼序列的指導,次序添加氨基酸從N端向C端,延伸肽鏈,直到合成終止的過程◆每次循環(huán)增加一個氨基酸，包括以下三步：

進位(entrance)

轉肽(peptidebondformation)

移位(translocation)◆延長因子(elongationfactor,EF)

EF-Tu:促進氨基酰-tRNA進入A位

EF-Ts:調節(jié)亞基

EFG:轉位酶活性，促進卸載tRNA釋放3、肽鏈的延長（elongation）原核生物：7/20/202358根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導，使相應氨基酰-tRNA進入核蛋白體A位。

TuTsGTPGDPAUG5'3'TuTsGDPTu-GTP進位

(entrance)7/20/202359延伸因子（elongationfactor）(1)當GTP存在時，EF-Tu呈活性狀態(tài)。(2)當GTP水解成GDP時，EF-Tu便失活。(3)GDP被GTP取代后，它又恢復活性。7/20/202360由轉肽酶(transpeptidase)催化的肽鍵形成過程肽基轉移酶轉肽（transpeptidation）7/20/202361轉肽酶肽鍵位置轉肽酶（大亞基）催化形成肽鍵P位：f-met-（肽酰）的α-COO-+A位：氨基酰的α-NH4+

形成肽鍵A位：反應在此位上進行（P位上的f-met退至A位）生成的二肽在A位上。P位空留：P位上無負載的tRNA在肽鍵形成前脫落。（出位，E位）7/20/202362轉位（Translocation)EF-G

有轉位酶(translocase)活性,可結合并水解GTP，促進核糖體向mRNA的3'側移動7/20/202363轉位

在A位的二肽鏈從A位進入P位酶位置方向轉位酶----EF-G有GTP酶活性P位：肽-tRNA-mRNAA位：空留下一個AA進入mRNA：從5’3’移動1個帶有肽鏈的tRNA：從A位P位肽鏈合成：從N端C端延長7/20/202364fMetAUG5'3'fMetTuGTP7/20/2023657/20/202366

真核生物翻譯的延伸7/20/2023674、翻譯的終止（termination）需要釋放因子（RF）的參與。

原核生物RF：RF-1、RF-2、RF-3

真核生物RF：eRF

RF1：作用于UAA、UAGRF2：作用于UGA、UAARF3：促進釋放結合GTP/GTP酶活性當核蛋白體出現(xiàn)mRNA的終止密碼后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰－tRNA中釋出，mRNA、核糖體大、小亞基等分離，這些過程稱為肽鏈合成終止。7/20/202368UAG5'3'RFCOO-7/20/202369真核細胞蛋白質合成的特點核糖體為80S，由60S的大亞基和40S的小亞基組成起始密碼AUG起始tRNA為Met－tRNAiMet起始復合物結合在mRNA5’端AUG上游的帽子結構，真核mRNA無富含嘌呤的SD序列（除某些病毒mRNA外）由多種起始因子參與（eIF1,eIF2,eIF3等十多種

）真核細胞核蛋白體沒有E位，轉位時卸載的tRNA直接從P位脫落肽鏈延伸因子（EF1,EF2）及釋放因子（RF可識別3種終止子）7/20/202370五、蛋白質的運輸及翻譯后修飾1974年，布洛貝爾發(fā)表了“信號假說”，推測分泌出細胞的蛋白質包含一內(nèi)在的轉運與定位信號，決定著其到達并跨越相應的細胞膜結構。

后來，布洛貝爾發(fā)表了蛋白質針對特定的細胞結構排列定位的普遍原理：每一蛋白質結構中都含有定位于細胞內(nèi)特異位置所需的信息；特定的氨基酸序列決定著蛋白質是穿越細胞膜結構，還是成為膜的組成部分，或是被轉運出細胞外。

7/20/2023717/20/202372◆信號序列(signalsequence)

所有靶向輸送的蛋白質結構中存在分選信號，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導蛋白質轉移到細胞的適當靶部位，這一序列稱為信號序列靶向輸送蛋白信號序列或成分分泌蛋白信號肽內(nèi)質網(wǎng)腔蛋白信號肽C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)線粒體蛋白N端靶向序列（20～35氨基酸殘基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val）過氧化體蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）溶酶體蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）靶向輸送蛋白的信號序列或成分（1）信號肽引導蛋白質達到靶部位7/20/202373多位于多肽鏈的N端10－40個氨基酸殘基N端:帶正電荷氨基酸殘基中間:疏水的核心區(qū)C端:可被信號肽酶識別并裂解信號肽1—10aa15—20aa15—30aa1—3aa富含Arg+,Lys+-----富含Phe,Leu,Ile…親水螺旋疏水螺旋S.S.酶切割位點7/20/202374信號識別體（signalrecognitionparticle，SRP）由一分子RNA(長300nt)和6個不同的多肽分子組成

SRP有兩個功能域：一個用以識別信號肽，另一個用以干擾進入的氨酰-RNA和肽酰移位酶的反應，以終止多肽鏈的延伸作用。

7/20/202375信號肽引導真核分泌蛋白進入內(nèi)質網(wǎng)信號肽與SRP結合→肽鏈延伸終止→SRP與受體結合→SRP脫離信號肽→肽鏈在內(nèi)質網(wǎng)上繼續(xù)合成，同時信號肽引導新生肽鏈進入內(nèi)質網(wǎng)腔→信號肽切除→肽鏈延伸至終止→翻譯體系解散7/20/2023767/20/2023777/20/2023787/20/202379（2）線粒體蛋白的靶向輸送7/20/202380線粒體前體蛋白信號序列的特點是：①多位于肽鏈的N端，由大約20個氨基酸構成；②沒有帶負電荷的氨基酸，形成一個兩性α螺旋，帶正電荷的氨基酸殘基和不帶電荷的疏水氨基酸殘基分別位于螺旋的兩側；③對所牽引的蛋白質沒有特異性要求，非線粒體蛋白連接上此類信號序列，也會被轉運到線粒體。

7/20/202381信號序列定位轉運裝置信號序列位置位于N端，富含帶正電荷的和疏水的氨基酸，形成兩性α螺旋，轉運后被切除。基質TOMTIM23不被切除，含疏水性的停止轉移序列，被安插到外膜。外膜TOM被切除，含疏水性的停止轉移序列，被安插到內(nèi)膜。內(nèi)膜TOMTIM23含兩個信號序列，首先轉運到基質，第一個信號序列被切除，第二個信號序列引導蛋白進入內(nèi)膜或膜間隙。內(nèi)膜膜間隙TOMTIM23結構類似于N端信號序列，但位于蛋白質內(nèi)部。內(nèi)膜TOMTIM23為線粒體代謝物的轉運蛋白，如腺苷轉位酶，具有多個內(nèi)部信號序列和停止轉移序列，形成多次跨膜蛋白。內(nèi)膜TOMTIM22線粒體蛋白分選信號7/20/202382（3）細胞核蛋白的靶向輸送7/20/202383六、蛋白質前體的共價修飾肽鏈N端殘基fMet或Met的切除；二硫鍵的形成；氨基酸側鏈的共價修飾；磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、腺苷酸化等蛋白質的剪切； 7/20/202384一級結構的加工修飾：1．N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸，必須在多肽鏈折迭成一定的空間結構之前被切除。①去甲?；?/p>

甲酰化酶甲酰蛋氨酸-肽甲酸+蛋氨酸-肽

②去蛋氨?；?/p>

蛋氨酸氨基肽酶

蛋氨酰-肽

蛋氨酸

+肽

六、蛋白質前體的共價修飾7/20/2023857/20/202386

2．氨基酸的修飾：由專一性的酶催化進行修飾，包括糖基化、羥基化、磷酸化、甲?；?。

3．二硫鍵的形成：由專一性的氧化酶催化，將-SH氧化為-S-S-。

4．肽段的切除：

由專一性的蛋白酶催化，將部分肽段切除。

7/20/202387高級結構的形成：1．構象的形成：在分子伴侶及輔助酶的協(xié)助下，形成特定的空間構象。2．亞基的聚合。3．輔基的連接。

7/20/2023887/20/2023897/20/202390Thefirstreactionisanattackbyan-OHor-SHsidechainofthefirstaminoacidintheinteinonthepeptidebondthatconnectsittothefirstextein.Thistransferstheexteinfromtheamino-terminalgroupoftheinteintoanN-OorN-Sacylconnection.Thenthisbondisattackedbythe-OHor-SHsidechainofthefirstaminoacidinthesecondextein.Theresultistotransferextein1tothesidechainoftheamino-terminalacidofextein2.Finally,theC-terminalasparagineoftheinteincyclizes,andtheterminalNHofextein2attackstheacylbondtoreplaceitwithaconventionalpeptidebond.Eachofthesereactionscanoccurspontaneouslyatverylowrates,buttheiroccurrenceinacoordinatemannerrapidlyenoughtoachieveproteinsplicingrequirescatalysisbytheintein7/20/202391（一）抗生素（antibiotics)

由微生物產(chǎn)生的具有抑制其它生物生長的物質。

1.四環(huán)素（tetracyclin）族

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