家畜配子與胚胎生物工程課件

家畜配子與胚胎生物工程胚胎移植家畜胚胎移植概論胚胎移植的概念及基本操作過程胚胎移植在畜牧生產(chǎn)上的意義胚胎移植的生理學基礎和原則生理學基礎胚胎移植的基本原則胚胎移植的技術程序供體母畜和受體母畜的選擇超數(shù)排卵供體母畜的配種胚胎的收集（手術法、非手術法）胚胎的評定(正常胚胎、形態(tài)異常胚胎)胚胎的保存和培養(yǎng)胚胎冷凍、移植具體操作體外受精技術體外受精卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)體外受精過程精子的處理受精方法影響體外受精效果的因素胚胎培養(yǎng)克隆與核移植胚胎分割胚胎分割

胚胎分割的方法分割胚的發(fā)育影響分割胚發(fā)育的因素胚胎分割技術的應用核移植核移植供體細胞的準備受核細胞的準備和去核去核移核細胞融合活化處理化學激活電激活重組胚移植轉(zhuǎn)基因動物技術轉(zhuǎn)基因動物技術轉(zhuǎn)基因動物技術的發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因動物技術的應用與前景轉(zhuǎn)基因動物技術存在的問題建立轉(zhuǎn)基因動物的方法轉(zhuǎn)基因動物的檢測性別鑒定與性別控制性別鑒定與性別控制性別鑒定細胞遺傳學方法H-Y抗原測定法SRY-PCR法性別鑒定性別控制免疫分離精子法用流式細胞分類儀分離精子本章結(jié)束！胚胎移植(EmbryoTransfer，ET)又稱受精卵移植，是把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮內(nèi)沖洗出來，移植到另一頭雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的技術。其中提供胚胎的動物稱為供體（Donor），接受和孕育胚胎的動物稱為受體(recipient)。胚胎移植的意義從根本上說就是縮短優(yōu)良母畜的繁殖周期，增加一次生產(chǎn)后代的數(shù)量。因此與其相關的工作都會用到此項技術，例如家畜育種中對優(yōu)良畜種的大量生產(chǎn)、對稀有品種的迅速擴繁等。同時由于家畜胚胎的可攜帶性，又使其可以代替活畜進口，由于胚胎不依賴于母畜的直接接觸，這樣就可以防止疾病的傳播。母畜發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育早期胚胎的游離狀態(tài)胚胎移植與免疫排斥的影響胚胎的遺傳特性胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性分類學上的相同屬性生理上的一致解剖部位的一致胚胎收集的期限胚胎的質(zhì)量保證主要指母畜的生理狀況。供體要具較高的育種價值、對超數(shù)排卵反應良好。受體要具有良好的繁殖性能、體型要大。方法的改進：1、PMSG方面

2、FSH方面

3、其他方面抗冷凍保護劑胚胎冷凍的主要方法控溫冷凍保存玻璃化冷凍抗冷凍保護劑胚胎冷凍所用的保護劑主要分為三類：(1)滲透性的：丙三醇、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺等；(2)非滲透性的：葡萄糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FCS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；卵母細胞的采集和選擇體外成熟的判定影響卵母細胞體外成熟的因素卵母細胞的培養(yǎng)卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)基礎培養(yǎng)體系腔前卵泡體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)育阻滯現(xiàn)象體外培養(yǎng)體系

合成液培養(yǎng)系統(tǒng)

共同培養(yǎng)系統(tǒng)方法之一：解剖顯微鏡下觀察卵丘細胞是否擴展松散, 擴展好的，一般認為是已成熟的卵母細胞。方法之二：是用吸管吹打法或透明質(zhì)酸酶分解法除去卵 丘細胞，以觀察在卵周隙中是否有第一極體，但要 觀察第Ⅱ次減數(shù)分裂(MⅡ)中期的核，需制片染色。方法之三：采集的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵 丘卵母細胞復合體。任何方法采集的COC都要求卵 母細胞形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細 胞緊密包圍(圖示1、圖示2）。

影響卵母細胞體外成熟的因素

動物的種類不同；卵母細胞類型；卵泡直徑與卵母細胞體外成熟能力有關；卵母細胞離體操作的時間和條件；采卵季節(jié)有關；基礎培養(yǎng)液以合成培養(yǎng)液如TCMl99應用最多。緩沖體系以Hepes

或碳酸氫鹽緩沖系(Earle’sSalts)為好，而磷酸鹽緩沖系 (Hank’s)較差。培養(yǎng)條件是5％CO2、95％空氣飽和濕度，多 采用微滴法(100μL,l0～15個卵母細胞)。添加犢牛血清、發(fā)情牛血清、胎牛血清、發(fā)情山羊血清或牛血白 蛋白(BSA)等。使用濃度5％～10％，BSA濃度3～5mg／mL添加促性腺激素，主要有HCG或PMSG、FSH+LH。添加雌激素對 卵母細胞體外成熟的影響尚存分歧。添加發(fā)情牛血清、發(fā)情 山羊血清時，主張無激素培養(yǎng)法?；A培養(yǎng)液中添加卵泡液(BFF)、顆粒細胞或中糖卵管上皮細胞利 于卵母細胞體外成熟。培養(yǎng)腔前卵泡培養(yǎng)基主要有MEM,GMEM,TCMl99和 WavmouthMB752/l培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基中添加血清、成熟分裂抑制劑、促性腺激素、類 固醇激素和生長因子等。培養(yǎng)方法有微滴法、瓊脂包埋培養(yǎng)法、膠原蛋白鋪層培 養(yǎng)法(二維法)和膠原蛋白包埋培養(yǎng)法(三維法)。分離培養(yǎng)腔前卵泡研究已在小鼠、倉鼠、大鼠、兔、貓、 豬和牛均有報道，并以小鼠和牛研究較多，但僅在 小鼠獲得后代。精子的預處理浮游程序（swimup）玻璃棉過濾程序BSA/Percoll

密度梯度透明質(zhì)酸的作用精子洗滌精子濃度精子活力的提高咖啡因PHE腺苷及其類似物血小板激活因子谷胱甘肽己酮可可堿和茶堿體外獲能處理方法肝素處理高離子強度液處理高pH值處理黃嘌呤咖啡因處理牛卵泡液豬卵泡液子宮液、輸卵管液精子活力激動劑鈣離子載體處理調(diào)整獲能精子濃度，制成小滴，覆蓋石蠟油，經(jīng)培養(yǎng)30～ 60min。將體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞加入與之共孵育。精 卵共孵育時間與受精體系有關。洗去多余精子和卵丘 細胞，轉(zhuǎn)移至受精卵培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。受精卵標志 是雌、雄原核，排出第二極體，或發(fā)育到卵裂期胚胎。顯微受精(microfertilization)。它是利用顯微操作儀將精子直接 注入卵母細胞內(nèi)，使精卵結(jié)合的生命過程，已在小鼠、 兔、牛和人類取得成功并獲得后代。卵母細胞的來源和成熟狀態(tài)；精子來源和密度、精子的活力；培養(yǎng)基的選擇；受精滴的大小；精卵比例；精卵相互作用時間、濕度、溫度和氣相等；利用成分確定的合成液：添加血清、BSA、維生素和氨 基酸、丙酮酸鈉等物質(zhì)，便于研究 發(fā)育過程中某一 種物質(zhì)對胚胎的作用機制，有助于了解胚胎早期發(fā) 育和代謝機理，但囊胚發(fā)育率不高。分步培養(yǎng)法：根據(jù)胚胎發(fā)育不同生長階段對不同物質(zhì)和 代謝不同，采用不同培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，包括含血清 和／或BSA的蛋白培養(yǎng)體系和無蛋白培養(yǎng)體系。屠 宰場收集的牛卵母細胞經(jīng)體外培養(yǎng)至成熟，體外受 精得到受精卵采用半確定培養(yǎng)液兩步培養(yǎng)系統(tǒng)．其 桑椹胚發(fā)育率高達50％。利用輔助細胞或飼養(yǎng)細胞(主要有輸卵管上皮細胞、顆粒／卵丘細胞、子宮內(nèi)膜細胞、腎細胞、成纖維細胞和水牛、大鼠肝細胞BRL等)在體外與受精卵共同培養(yǎng)促進胚胎發(fā)育可得較高的囊胚發(fā)育率。共同培養(yǎng)中仍存在選擇何種體細胞最適宜，是否存在特異性或非特異性胚胎生長因子等。由于體細胞的加入，使培養(yǎng)液成分更加復雜，很難從中分析出影響培養(yǎng)效果的具體因素，而且胚胎和體細胞對培養(yǎng)的各種條件要求不一，故尚未有令人滿意的結(jié)果。毛細管吹吸法顯微手術法徒手分割法免疫手術法2-細胞到8-細胞分割胚的發(fā)育桑椹期和囊胚期分割胚的發(fā)育胚胎分割的時期胚胎的分割程度透明帶的有無分割胚的培養(yǎng)條件胚胎性別移人受體的胚胎數(shù)分割胚的保存胚細胞核移植構建異源重構胚胎研究遺傳-環(huán)境相互作用產(chǎn)生嵌合體產(chǎn)前診斷提高體外受精的妊娠率這種方法主要適用于分離2-細胞到8-細胞期卵裂球。在顯微操作儀的幫助下，在無鈣、鎂離子的培養(yǎng)液中，用固定針吸住胚胎，用另一玻璃針挑開胚胎的透明帶，細胞團自透明帶中脫出。再用僅能通過胚胎的毛細管吹吸胚胎，得到單個卵裂球，再將卵裂球裝入空的透明帶中，體外培養(yǎng)至一定時期，移植入受體中。這種方法主要適用于分割桑椹胚和囊胚。在顯微操作儀的幫助下，以固定針吸住胚胎，用玻璃針或顯微手術刀將胚胎對稱切割。在切割桑椹胚時，需在不含鈣、鎂離子的培養(yǎng)液中，以降低細胞間的連接，降低由于切割造成的損傷。對胚胎的分割要注意對稱，尤其是囊胚，要注意將內(nèi)細胞團對稱地一分為二。徒手分割法主要適用于分割體積較大的胚胎，其優(yōu)勢在于可以不用顯微操作儀。在立體顯微鏡下，用止血鉗夾住切割刀片，將透明帶切開一部分，再用直徑略小于胚胎的毛細管吹吸幾次，胚胎從透明帶中脫出。手持玻璃針自上而下對稱切割裸胚。這種方法多用于分割桑椹胚和囊胚。免疫手術法利用處于囊胚期的胚胎其滋養(yǎng)層細胞之間已形成緊密連接，能阻擋外部抗體分子進入囊胚腔。方法：將胚胎置于抗血清中，使滋養(yǎng)層細胞與抗體分子充分結(jié)合，然后在補體的協(xié)助下，利用免疫反應，溶解外層的滋養(yǎng)層細胞，而未結(jié)合抗體分子的內(nèi)細胞團則保持完整。這樣分離的內(nèi)細胞團可注射人另一胚胎的囊胚腔中，或與處于桑椹期的其他胚胎整合，這樣可產(chǎn)生嵌合體。對早期胚胎細胞，先用1%的鏈酶蛋白酶或pH2.5的臺氏液去掉透明帶，再用機械吹打或酶消化法使其分散為單個游離的卵裂球。體細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，將細胞接種培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)中。后放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至70%-80%時傳代3-8代時用于核移植。核移植操作前3-5d，將培養(yǎng)基中的血清濃度降至0.5%進行饑餓，使其處于G0期。但對血清饑餓是否必需還未定論。透明帶切開法(兩步法)透明帶切口去核一步法Hochest染色去核法時間控制去核法化學去核法2.5%蔗糖處理去核法末期去核法帶下移植胞質(zhì)內(nèi)注射化學融合仙臺病毒(H1V)融合

電融合7%乙醇離子霉素A231876-DMAPStaurosporineSrCl2融合時將待融合卵先經(jīng)融合液處理，3-5min后移人電融合槽中。用人工或交流電使待融合卵定位。不同動物所用的刺激強度不同。電刺激后，盡快把重構卵移出，新鮮培養(yǎng)液中洗3次后，培養(yǎng)20～30min檢查融合情況。檢查方法有：①觀察供體細胞和受體細胞的接觸面是否已消失。供體核 是否已進入卵母細胞，這是最明確的證據(jù)；②采用Hochest33342染色，熒光下觀察供體核物質(zhì)是否進 入受體胞質(zhì)中；③檢查透明帶下卵周隙是否存在退化或被損壞的供體細胞 碎片。電激活根據(jù)其在核移植前或后進行而分為前激活?融合激活和后激活。電激活一般采用強度100V/mm，持續(xù)時間為50-80μs的一個直流脈沖即可。在實際應用中，應考慮不同動物卵母細胞的卵齡和MPF下降水平的關系，選擇合適的時間進行核移植以獲得良好的效果。最近，Loi等(1998)證明，采用離子霉素激活后再用6-DMAP處理3h，可避免出現(xiàn)早熟染色體凝集(PCC)，并且明顯增加羊重構胚的發(fā)育率及出生率?；虮磉_和調(diào)控的研究轉(zhuǎn)基因動物模型轉(zhuǎn)基因動物生物反應器轉(zhuǎn)基因改良移植器官改良動物品種轉(zhuǎn)基因動物的效率較低轉(zhuǎn)基因表達的混亂轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鲃游锏挠绊?/p>

顯微注射法

胚胎干細胞法反轉(zhuǎn)錄病毒載體法精子載體法DNA的制備及其對轉(zhuǎn)基因效率的影響酶解、分離與抽提、氯化銫離心收集DNA溶液、透析與定量緩沖液的配制受精卵的獲取顯微注射注射卵的移植輸卵管移植、子宮移植胚胎干細胞的培養(yǎng)ES細胞的基因組操作ES細胞的子宮轉(zhuǎn)移反轉(zhuǎn)錄病毒的增殖與整合反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建反轉(zhuǎn)錄病毒的感染與導入精子對外源DNA攝取精子與外源DNA作用方法混合培養(yǎng)法電穿孔法脂質(zhì)體介導法精子與外源DNA結(jié)合部位影響精子與DNA結(jié)合的因素基因組DNA的提取

目的基因的整合檢測

外源基因整合位點的檢測斑點印跡(spotblot)法Southern印跡(Southernblot)法聚合酶鏈反應(PCR)染色體原位雜交(insituhybridization)法轉(zhuǎn)錄水平的檢測Northern印跡(Northernblot)法反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法RNase保護分析