食品生物技術(shù)導(dǎo)論基因工程

食品生物技術(shù)導(dǎo)論基因工程1第1頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基因工程概述一、基因及其發(fā)展簡史二、基因工程涵義三、基因工程的一般步驟第2頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因概念基因是DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列。指導(dǎo)人體內(nèi)重要物質(zhì)蛋白質(zhì)等的合成，維持著人體的正常生理功能。如果一個(gè)基因不正常，甚至基因中一個(gè)非常小的片斷不正常，就可以引起發(fā)育異常、疾病，甚至死亡?；蚴腔蚬こ痰牟僮鲗ο?第3頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月基因（gene）——生命的最大奧秘物質(zhì)層面：是染色體上一段脫氧核糖核酸（DNA）序列。功能層面：是遺傳信息的載體，編碼蛋白質(zhì)和核糖核酸（RNA）分子功能，調(diào)控基因表達(dá)?；?基因2DNA染色體4第4頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA結(jié)構(gòu)戊糖磷酸單核苷酸堿基脫氧核糖和磷酸基通過3′,5′磷酸二酯鍵連接形成螺旋鏈的骨架5第5頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3端3端5端5端磷酸二酯鍵6第6頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)第7頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1865孟德爾的豌豆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了遺傳規(guī)律：

同對因子分離異對因子自由組合首次提出了“遺傳因子”（即基因）現(xiàn)代遺傳學(xué)之父，奧地利生物學(xué)家格雷戈?duì)枴っ系聽?、基因發(fā)展簡史8第8頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1915年至1928年摩爾根的果蠅實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了孟德爾因子和孟德爾定律兩大重要發(fā)現(xiàn)：基因是在染色體上，遺傳的基因鏈鎖和互換定律。即建立了作為摩爾根理論主要基礎(chǔ)的基因?qū)W說。美國遺傳學(xué)家摩爾根9第9頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1953年最偉大的模型

——DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提出的DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，在英國《自然》雜志上發(fā)表了論文并1962年獲得諾貝爾獎。提出了DNA的復(fù)制機(jī)制—即半保留復(fù)制。美國生物化學(xué)家沃森（左一）英國生物物理學(xué)家克里克(左二）從分子水平揭示了種瓜得瓜，種豆得豆的遺傳機(jī)理10第10頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA半保留復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)每個(gè)子代DNA分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。第11頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因工程涵義第12頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因工程誕生的基礎(chǔ)（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)40年代確定的遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)（肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)）50年代揭示的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制。50年代末－60年代：中心法則＆操縱子學(xué)說及遺傳密碼的破譯。13第13頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月14第14頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月中心法則描述的是遺傳信息傳遞表達(dá)路徑的原理。15第15頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）基因工程研究的理論依據(jù)基因可以重組互換基因可切割基因可轉(zhuǎn)移遺傳密碼是通用的多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系基因可通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代16第16頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）技術(shù)上的三大發(fā)明

60年代末－70年代：DNA分子的體外切割與連接技術(shù)。70年代：基因工程載體的使用。70年代：DNA分子的序列分析、瓊脂糖凝膠電泳、雜交技術(shù)等。1973年Cohen等體外構(gòu)建細(xì)菌質(zhì)粒的成功標(biāo)志著基因工程誕生，這年定為基因工程誕生元年。17第17頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、基因工程概念(Geneengineering)指用酶學(xué)方法將異源基因與載體DNA進(jìn)行體外重組，將形成的重組DNA導(dǎo)入宿體細(xì)胞，使異源基因在宿體細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，從而達(dá)到改造生物品種或性狀，大量生產(chǎn)出人類所需的生物品種和產(chǎn)物，也稱分子克隆或重組DNA技術(shù)。工具酶目的或靶基因(源自供體)受體載體基因工程的基本內(nèi)容和關(guān)鍵技術(shù)最終目的第18頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3、基因工程的主要內(nèi)容從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。19第19頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因工程的一般步驟第20頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月生物材料RNADNAmRNAcDNA文庫基因組文庫人工合成目的基因克隆載體重組DNA受體細(xì)胞克隆子轉(zhuǎn)基因生物1、基因工程基本技術(shù)路線21第21頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)2、基因操作的基本步驟載體供體目的基因受體工具酶第22頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月即基因工程是基因的一種操作平臺與技術(shù)基因工程五大基本操作單元：

切、接、轉(zhuǎn)、增、檢

DNA的體外重組轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供可能可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增23第23頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月工具酶目的基因（制備）基因載體基因受體基因工程四大要素24第24頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)工具酶基因工程技術(shù)中對核酸的精雕細(xì)刻主要用酶作為工具第25頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月一、限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）

1、概念指一類以環(huán)形或線形雙鏈DNA為底物，能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下使每條鏈一定位點(diǎn)上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-P基團(tuán)的DNA片段的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。26第26頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月I型酶：在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，識別特異性差，且需輔助因子，應(yīng)用價(jià)值不大。II型酶：在其識別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈，專一性強(qiáng)，識別與切割序列一致，且無需輔助因子或只需Mg2+，適合基因工程。

III型酶：在識別位點(diǎn)之外切開DNA鏈，并且要求識別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，無規(guī)律；很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒有人將其商業(yè)化。

2、限制性內(nèi)切酶種類27第27頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1973年由H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)由三部分構(gòu)成，即菌系編號、菌株名、分離順序。

（1）用屬名的第一個(gè)字母（大寫）和種名的前兩個(gè)字母（小寫）組成的3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名，斜體書寫。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。（2）菌株名以非斜體符號加在前三個(gè)字母后面。如Ecok,EcoR（3）同一菌株中有不同的限制性內(nèi)切酶時(shí)，按分離順序用羅馬字母表示，正體書寫。如EcoRI，EcoRV。3、限制性內(nèi)切酶命名原則28第28頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月例如：流感嗜血菌d株

屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

dHindⅢ29第29頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）作用機(jī)制限制性內(nèi)切酶以環(huán)狀或線性的雙鏈DNA為底物，在一定條件下，識別一定的核苷酸序列，在兩條鏈的特定的磷酸二酯鍵上催化切開，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-P基團(tuán)的DNA片段。4、限制性內(nèi)切酶作用機(jī)制和方式30第30頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酶切特點(diǎn)識別雙鏈DNA分子中4—8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的對稱回文結(jié)構(gòu)。

EcoRⅠ的切割位點(diǎn)

EcoRⅠ的識別序列5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’切割位置識別結(jié)構(gòu)識別長度第31頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月識別序列：限制性核酸內(nèi)切酶在雙鏈DNA上能夠識別的特殊核苷酸序列。（同分子中識別序列短的出現(xiàn)幾率大，反之亦然）稀切酶：能夠識別長序列及富集GC和AT的識別序列（幾率?。┑膬?nèi)切酶。同裂酶：識別相同序列的限制酶同尾酶：識別序列不同，但切割得到的DNA片段具有相同的黏性末端。各種類型見P18-1932第32頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月黏性末端：被限制酶交錯(cuò)切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間堿基正好互補(bǔ)配對。（5’粘性和3’粘性）

GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG（3）切割方式5’-P3’-OH3’-OH5’-P5’-P5’-P3’-OH3’-OHEcoRⅠ形成具有互補(bǔ)堿基序列的單鏈黏性末端5’-GAATTC-3’第33頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月EcoRⅠ產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’37℃4~7℃5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ34第34頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PstI產(chǎn)生的3‘粘性末端

5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’37℃4~7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI35第35頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月例如：EcoRV的識別位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

其切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。平整末端：同一位點(diǎn)平齊切割DNA兩條鏈而形成的雙鏈末端。

36第36頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)底物（DNA）內(nèi)切酶用量（活力決定）反應(yīng)緩沖液（最適pH7.5）適當(dāng)?shù)臏囟龋?7℃）5、限制性內(nèi)切核酸酶反應(yīng)系統(tǒng)第37頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)系統(tǒng)緩沖液Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mM低鹽酶：0~50mMNaCl0~150mM中鹽酶：100mMDTT/BSA1mM高鹽酶：150mMVolume20~100μLT,T37℃，1~1.5h1U核酸內(nèi)切酶的活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量。38第38頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳：DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動，不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。電泳的驅(qū)動力靠DNA骨架本身的負(fù)電荷。聚丙烯酰胺凝膠電泳：原理同，均為分子篩效應(yīng)。使用特點(diǎn)：瓊脂糖凝膠在分離度上比聚丙烯酰胺凝膠電泳差一些，而在分離范圍上優(yōu)于聚丙烯酰胺。一般瓊脂糖凝膠適用于分離大小在0.2-50Kb范圍內(nèi)的DNA片段。鑒定——凝膠電泳39第39頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月40第40頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月觀察:凝膠成像系統(tǒng)第43頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月pBI121雙酶切大片段的獲得

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pMD18-T–curcin雙酶切小片段的獲得SmallfragmentobtainedfrompMD18-T–curcinafterdoubleenzymedigestion13kb

酶切片段第44頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、DNA連接酶1、概念：能催化DNA分子中相鄰的3’-OH和5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵，即可封閉雙鏈DNA上相鄰核苷酸之間的單鏈缺口。45第45頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、主要的兩種DNA連接酶

（1）大腸桿菌-DNA連接酶：只能連接黏性末端，需NAD+為輔助因子。（同一種限制酶或兩種同尾酶）（2）T4-DNA連接酶：連接黏性末端、平整末端，需ATP為輔助因子。（同一種或兩種限制酶）

作用：DNA重組中促使載體與目的DNA連接（即兩種來源的DNA）。（最適溫度37℃，或4~15℃）46第46頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’37℃EcoRⅠ5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’P-A-A-T-T-C-X-‥-Y-G-OHOH-G-Y-‥-X-C-T-T-A-A-P大腸桿菌連接酶-X-‥-Y--Y-‥-X-第47頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月載體供體目的基因受體工具酶第48頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）DNA片段末端修飾核酸外切酶：切成平整末端末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶：修飾成互補(bǔ)黏性末端堿性磷酸酶：將5’-P修飾成5’-OH，防止載體自我環(huán)化（2）DNA片段加連桿后連接人工合成連桿或銜接頭3、非互補(bǔ)黏性末端、非平整末端的連接第49頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月三、其他工具酶DNA聚合酶：PCR擴(kuò)增T4多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸轉(zhuǎn)移至5’-OH上，作為DNA的5’-末端標(biāo)記。S1核酸酶：分析DNA-RNA雜合子結(jié)構(gòu)；反向轉(zhuǎn)錄酶：以RNA為模板，反向轉(zhuǎn)錄形成與已知RNA互補(bǔ)的DNA鏈（構(gòu)建cDNA文庫）。50第50頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)目的基因的制備一、生物學(xué)方法二、化學(xué)合成法三、基因文庫法四、PCR擴(kuò)增法51第51頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、目的基因的定義

目的基因：指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或DNA片段，能編碼某一產(chǎn)物或某一性狀，又稱特異基因或靶基因。

2、目的基因的來源

真核生物染色體基因組（人和動物）；原核生物染色體；質(zhì)粒、病毒、線粒體、葉綠體等。52第52頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月一、生物學(xué)方法工作原理：把染色體DNA用限制內(nèi)切酶切割，將所有片段鏈接到某載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中增殖。再用適當(dāng)方法篩選出含目的基因的的重組體菌落，從重組體菌落提取DNA，經(jīng)酶切后獲得目的基因。53第53頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月ori目的基因EcoRIBamHIPstI對象：原核生物基因組較小，基因容易定位，或已知核苷酸序列的DNA分子。優(yōu)點(diǎn)：快速簡便、產(chǎn)物純度高。54第54頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、化學(xué)合成法如果已知某基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出該多肽編碼基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。通常是先合成一定長度（~200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。然后將寡核苷酸適當(dāng)連接組裝成完整的目的基因55第55頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月①合成引物②合成DNA寡核苷酸連桿③合成基因片斷④DNA片斷的連接重組，采用DNA片段的連接酶有E.coliDNA、T4-DNA連接酶步驟：56第56頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月工作原理：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一種受體菌克隆子群體之中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫。包含某種生物基因組全部基因的受體菌群體稱為該生物的基因組文庫。三、基因文庫法57第57頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月抽提基因組DNA制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌體篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）基因文庫構(gòu)建流程圖物理方法(剪切或超聲波)或限制性內(nèi)切酶

λ噬菌體、plasmid、YAC等每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。全部細(xì)菌所攜帶的各種染色體DNA片段就涵蓋了基因組全部信息，即基因文庫。第58頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月構(gòu)建基因library++ligase59第59頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月Aplasmidlibrary60第60頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月四、PCR擴(kuò)增法（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

PolymerasechainreactionPCR技術(shù)是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新；1985年美國PE-Cetus公司的Millis等研制，于1993年獲諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)是指模擬DNA聚合酶在生物體內(nèi)的催化作用，在體外進(jìn)行特異DNA序列合成及擴(kuò)增的技術(shù)。前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。61第61頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。解旋酶—雙鏈變單鏈DNA聚合酶—使鏈延伸引物DNA的天然復(fù)制第62頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、PCR原理PCR技術(shù)的實(shí)質(zhì)為體內(nèi)DNA復(fù)制的體外模擬。即使雙鏈DNA熱變性而分開成為單鏈DNA，退火后在低溫下，兩個(gè)與模板互補(bǔ)的引物與單鏈DNA配對結(jié)合，再在中溫下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行聚合（延伸）反應(yīng)。每經(jīng)過一次變性、退火和延伸為一個(gè)循環(huán)，所擴(kuò)增的特定DNA序列數(shù)量按幾何指數(shù)增長。63第63頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)原理模板與引物的復(fù)性,引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。55?C在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA94?C從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈72?C變性退火延伸64第64頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復(fù)性循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復(fù)性鏈延伸Tag聚合酶鏈延伸第65頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增66第66頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月20-35cycles72℃5~7min4℃12h或更長時(shí)間72℃2~4min94~-96℃0.5~1min92~96℃4~6min60℃~37℃0.5-1min變性使雙鏈變?yōu)閱捂溚嘶鹗箯?fù)性引物與模板DNA結(jié)合Tac聚合酶使延伸2、PCR反應(yīng)過程67第67頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月①模板DNA的變性：模板DNA加熱至94~95℃一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；2、PCR反應(yīng)步驟68第68頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月③引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)“變性--退火--延伸”過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。第69頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增儀70第70頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3、PCR反應(yīng)體系反應(yīng)緩沖液

18（l）dNTP（原料基質(zhì)，由四種三磷酸脫氧核苷酸即dATP、dGTP、dTTP、dCTP組成）

2Primer1（引物）0.5Primer2（引物）0.5DNA分子（模板）1Mg2+（酶的輔助因子，10×buffer）2.5Taq酶（DNA聚合酶）0.571第71頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月4、PCR的特點(diǎn)靈敏度高——PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝。特異性強(qiáng)——引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵；引物設(shè)計(jì)的基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。簡便、快速、重復(fù)性好——一次性加好反應(yīng)液，2~4小時(shí)完成擴(kuò)增。對標(biāo)本的純度要求低——血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA。72第72頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)基因克隆載體一、質(zhì)粒二、λ噬菌體三、其他第73頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月基因載體的概念將外源DNA或目的基因帶入適當(dāng)宿主細(xì)胞（hostcell）的工具或運(yùn)載體。第74頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月本身是一個(gè)復(fù)制子，能自我復(fù)制；相對分子質(zhì)量較小，限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)少，宜于接受目的基因；能給宿主細(xì)胞（受體）提供可選擇標(biāo)記，有可供辨認(rèn)的表形特征，便于篩選；只有單一限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，即經(jīng)某限制性內(nèi)切酶切割后，即可把質(zhì)粒DNA閉環(huán)打開接納外源DNA片段，又不會丟失自己的片段。以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞利于載體制備載體應(yīng)具備的條件：提高外源基因的裝載量第75頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）是寓于宿主細(xì)胞中染色體外的遺傳因子，是雙螺旋閉環(huán)的DNA分子。獨(dú)立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳，又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，相對分子量1000~10000ku。廣泛存在于細(xì)菌、放線菌及酵母細(xì)胞質(zhì)中，某些藍(lán)藻、綠藻和真菌細(xì)胞中也存在質(zhì)粒。76第76頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體和質(zhì)粒的區(qū)別與聯(lián)系染色體與質(zhì)粒均與生物遺傳有關(guān)。二者都帶有能轉(zhuǎn)錄并能表達(dá)為蛋白質(zhì)的基因，染色體是生物信息的攜帶者，其帶有大量遺傳信息，而質(zhì)粒則是攜帶一些表達(dá)有特殊功能的蛋白質(zhì)的基因，有些是對生物絕對需要的。染色體與質(zhì)?；瘜W(xué)本質(zhì)不同：染色體的化學(xué)本質(zhì)是由蛋白質(zhì)和DNA組成的，質(zhì)粒是DNA，只有質(zhì)粒可以作為運(yùn)載體，染色體不可以。77第77頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體的一般特征染色體DNA質(zhì)粒DNA大腸桿菌細(xì)胞第78頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、質(zhì)粒類型

嚴(yán)緊型質(zhì)粒：處于“嚴(yán)緊控制”之下，即其復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒。79第79頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月

松弛型質(zhì)粒：處于“松弛控制”之下，每個(gè)細(xì)菌中可以有10～200份拷貝。更重要的是松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)可因宿主細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而增加至幾千份，如pBR322。宿主細(xì)胞不合成蛋白質(zhì)時(shí)，染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制都中止，但松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制。因此在增殖松弛型質(zhì)粒時(shí)，總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理（在培養(yǎng)液中加入適量的氯霉素）抑制蛋白質(zhì)的合成。第80頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、質(zhì)粒DNA的提取選擇性抽提法：在較溫和的條件下，用溶菌酶溶菌，形成的細(xì)胞碎片因染色體DNA和質(zhì)粒DNA有相對分子量上的差異，用高速離心方法分離。相對分子量較小的質(zhì)粒DNA留于上清液，經(jīng)乙醇沉淀得到質(zhì)粒DNA粗制品。堿性SDS法：在pH12.0~12.5范圍內(nèi)使染色體中雙螺旋開鏈DNA選擇性變性，而閉環(huán)雙鏈DNA不變性。經(jīng)乙酸鈉中和后，SDS引起蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和相對分子質(zhì)量高的DNA沉淀，再經(jīng)高速離心將質(zhì)粒DNA留于上清液中而分離。第81頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月堿性SDS法提取質(zhì)粒DNA的步驟收集細(xì)胞加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)離心除去沉淀，得含質(zhì)粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白質(zhì)乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA在強(qiáng)堿性環(huán)境中暴露時(shí)間過長，cDNA可發(fā)生不可逆變性第82頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3、質(zhì)粒DNA的純化堿性蔗糖密度梯度離心法：染色體雙螺旋開鏈DNA易變性，而閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA不易變性，在蔗糖濃度梯度中質(zhì)粒DNA沉降速度大于變性DNA而分離純化。氯化銫-溴化乙錠（Et-Br）密度梯度離心法：染色體雙螺旋開鏈DNA易和染料Et-Br結(jié)合而密度降低，質(zhì)粒DNA由于緊密閉合而不宜結(jié)合，密度大，經(jīng)離心分離。硝酸纖維素膜吸附法：硝酸纖維素膜吸附單鏈DNA，染色體DNA易變性形成單鏈，而與質(zhì)粒DNA分離。83第83頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月刪除非必需區(qū)：減小質(zhì)粒的分子量，提高外源DNA的裝載量（一般來說，大于20kb的質(zhì)粒很難導(dǎo)入受體細(xì)胞）。加入新的遺傳標(biāo)記基因：引入具有多種限制酶識別及切割位點(diǎn)的DNA序列：即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites，MCS)。4、質(zhì)粒的改造構(gòu)建84第84頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月常用質(zhì)粒載體：（1）大腸桿菌質(zhì)粒載體AmprTetr識別位點(diǎn)pBR322（4363bp）pBR322（含兩個(gè)抗生素抗性基因）抗氨芐青霉素抗四環(huán)素復(fù)制起始點(diǎn)第85頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18/19β半乳糖苷酶的肽基因—菌落藍(lán)/白選擇標(biāo)記加入第86頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月lacZ藍(lán)-白斑篩選：具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯LacZ’基因編碼β半乳糖苷酶，該酶能水解生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ’基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。稱之為藍(lán)-白斑篩選。第87頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）穿梭質(zhì)粒載體（shuttlevector）指能在兩種不同生物中復(fù)制的質(zhì)粒載體。如有的質(zhì)粒載體除了含大腸桿菌源質(zhì)粒的ori外，還含有藍(lán)藻源質(zhì)粒的ori，是這兩種生物的穿梭質(zhì)粒載體；還有的能在原核生物（如E.coli）、真核細(xì)胞（如酵母）中復(fù)制。含有不止一個(gè)ori、能攜帶插入序列在不同種類宿主細(xì)胞中繁殖的載體稱為穿梭載體（shuttlevectors）。

第88頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、λ噬菌體噬菌體（phage）是病毒的一種，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。因其缺乏代謝的酶體系，不能脫離宿主細(xì)胞而自行繁殖，只能在活體細(xì)胞中生長并對宿主細(xì)胞有嚴(yán)格專一性?？勺鳛榛蜉d體的主要是λ噬菌體。研究始于上世紀(jì)50年代，1974年Davis發(fā)現(xiàn)λ噬菌體失去20%的DNA仍不失活，認(rèn)為此缺失部分可裝載其他DNA，至今已構(gòu)建100多種。第89頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的主要類型：插入型載體（insertionvector）：為λ噬菌體基因組中缺失部分非必要基因，只含1個(gè)可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如charon6單切點(diǎn)是EcoRI。替換型載體（replacementvector）：在λ噬菌體的可替換片段兩端具有兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，酶切后替換片段與帶有所有必需基因的左右臂分開，由外源DNA代替。第90頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月三、其他載體M13

噬菌體：環(huán)狀單鏈DNA病毒：SV40、EBV等。91第91頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)基因重組基因重組：指將目的基因（或外源基因）與載體在體外結(jié)合構(gòu)建形成重組子。重組方式：以黏性末端連接法為主直接黏接：簡單、效率高加尾黏接：利用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶在DNA末端制造黏性末端。主要工具酶：T4-DNA連接酶（5’-P和3’-OH）92第92頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月重組率重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25~75%93第93頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’37℃EcoRⅠ5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’P-A-A-T-T-C-X-‥-Y-G-OHOH-G-Y-‥-X-C-T-T-A-A-P大腸桿菌連接酶-X-‥-Y--Y-‥-X-94第94頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第六節(jié)基因的轉(zhuǎn)化與表達(dá)一、目的DNA的導(dǎo)入二、擴(kuò)增檢篩三、目的基因表達(dá)95第95頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、宿主細(xì)胞（受體細(xì)胞）（1）概念：指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和雜交中接受外源基因DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，是重組體擴(kuò)增的場所。96第96頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物細(xì)胞：如大腸桿菌、枯草桿菌、放線菌、藍(lán)藻、農(nóng)桿菌等；真核生物細(xì)胞：主要是酵母特點(diǎn)：單細(xì)胞；非致病菌，安全；（2）宿主細(xì)胞類型：97第97頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、感受態(tài)感受態(tài)：指宿主細(xì)胞能吸收外源DNA分子而有效作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。取決于受體細(xì)胞自身的生理狀態(tài)及重組DNA分子的構(gòu)型和分子大小，一般宿主細(xì)胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。感受態(tài)細(xì)胞：能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。第98頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3、轉(zhuǎn)化根據(jù)選用的載體系統(tǒng)和受體細(xì)胞類型而定：用于微生物細(xì)胞基因?qū)氲挠兄苯愚D(zhuǎn)化法、化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法、電穿孔轉(zhuǎn)化法等；用于植物細(xì)胞基因?qū)氲挠形椶Z擊轉(zhuǎn)化法、激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法等。99第99頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化率：每微克重組DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不生長）。電穿孔轉(zhuǎn)化100第100頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、擴(kuò)增檢篩1、擴(kuò)增將目的基因與載體切割后連接成重組子（重組DNA）后導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子（菌落）被置于含有標(biāo)記抗菌素的豐富培養(yǎng)基上生長，細(xì)菌轉(zhuǎn)化繁殖后即完成目的基因的擴(kuò)增。便于篩選、鑒定101第101頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、篩選方法：將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在含適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。102第102頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月①根據(jù)載體抗生素抗性基因和相應(yīng)的選擇藥物篩選:

Ampr（抗氨芐青霉素）Tetr（抗四環(huán)素）pBR3224363bpori識別位點(diǎn)AmprTetr103第103頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月104第104頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月②利用乳糖操縱子lacZ’基因（藍(lán)白斑）篩選：

具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯LacZ’基因編碼β半乳糖苷酶，該酶能水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ’基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌。稱之為藍(lán)-白斑篩選。105第105頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA芯片：將許多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段（探針）固定在芯片的每個(gè)預(yù)先設(shè)置的區(qū)域，將待測樣本標(biāo)記后，利用堿基互補(bǔ)配對的原理同芯片進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號并進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，可同時(shí)檢測成千上萬個(gè)基因。③應(yīng)用DNA芯片鑒定重組子106第106頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月

蛋白質(zhì)凝膠電泳：PAGE免疫檢測法：

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）;

蛋白質(zhì)印跡法（Western

Bloting）；免疫沉淀法；固相放射性免疫測定法（RIA）。④根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、酶、多肽）篩選（無標(biāo)記基因或無法合成探針時(shí)）107第107頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月三、目的基因的表達(dá)基因表達(dá)：指使特異基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄、翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)（酶），獲得其代謝產(chǎn)物的過程。目的基因在插入載體后，在其編碼順序的5’端有能被受體細(xì)胞識別的啟動基因順序及能和核糖體結(jié)合的順序，則該目的基因就可以表達(dá)，從而使基因工程得以實(shí)現(xiàn)。108第108頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月1、來自PCR產(chǎn)物（染色體DNA、RNA提?。?、文庫篩選（染DNA、RNA）新產(chǎn)品、產(chǎn)物目的基因克隆載體連接重組DNA分子細(xì)菌中原核表達(dá)在植物中表達(dá)(轉(zhuǎn)基因植物)在酵母中表達(dá)病毒中表達(dá)分離純化上游技術(shù)下游技術(shù)酶切酶切轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞目的基因被克隆構(gòu)建其表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞PCR和酶切鑒定SouthernNorthernWestern

鑒定第109頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月第七節(jié)基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)基因微生物食品二、轉(zhuǎn)基因動物食品三、轉(zhuǎn)基因植物食品第110頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)基因食品

（GeneticallyModifiedFood，GMF）轉(zhuǎn)基因食品：是指用轉(zhuǎn)基因生物制造、生產(chǎn)的食品、食品原料及食品添加物等。主要指用作食品的轉(zhuǎn)基因植物類型：增產(chǎn)型；控熟型；高營養(yǎng)型；保健型；加工型；新品種型111第111頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月一、轉(zhuǎn)基因微生物食品1、定義：指由轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)生的食品；或利用轉(zhuǎn)基因微生物為原（輔）料上產(chǎn)加工的食品、食品添加劑；或以使用轉(zhuǎn)基因微生物制造的農(nóng)藥、肥料、飼料的動、植物所產(chǎn)生的食品。該轉(zhuǎn)基因微生物稱為工程菌。112第112頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月2、特點(diǎn)除轉(zhuǎn)基因益生菌培養(yǎng)增殖后作為發(fā)酵食品成分直接食用外，轉(zhuǎn)基因微生物一般不作為食品主要成分，而是作為食品加工的輔料成分，如酶制劑；以使用轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)生的農(nóng)藥、肥料、飼料生產(chǎn)的食品為間接的轉(zhuǎn)基因食品。安全性高。113第113頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月3、轉(zhuǎn)基因微生物食品的應(yīng)用（1）提高食品產(chǎn)品的品質(zhì)（2）簡化生產(chǎn)工藝，縮短生產(chǎn)周期（3）食品的抗菌和防腐保鮮（4）食品級酶制劑生產(chǎn)菌的改良（5）保健食品功效成分的生產(chǎn)（6）食品微生物的快速檢測114第114頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）提高食品產(chǎn)品的品質(zhì)面包酵母的改造應(yīng)用—最早成功應(yīng)用的工程菌：導(dǎo)入具有優(yōu)良特性的酶基因使麥芽透性酶及麥芽糖酶含量顯著提高，大大改善面包品質(zhì)。釀酒酵母的改造應(yīng)用：導(dǎo)入異源α-乙酰乳酸脫羧酶去除α-乙酰乳酸酶，減少或控制影響啤酒風(fēng)味的雙乙酰含量；導(dǎo)入硫酸鹽代謝途徑中的MET25基因，降低影響啤酒風(fēng)味的硫化氫含量?！ぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁぁ?15第115頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）簡化生產(chǎn)工藝，縮短生產(chǎn)周期啤酒酵母的改造應(yīng)用：導(dǎo)入大麥芽中的β-葡聚糖酶基因解決啤酒酵母不能分解利用大分子葡聚糖和糊精等物質(zhì)，改善啤酒發(fā)酵液的沉淀性；導(dǎo)入大麥芽中的α-淀粉酶基因使酵母便可直接利用淀粉進(jìn)行發(fā)酵，無需依賴麥芽生產(chǎn)α-淀粉酶的過程，可縮短生產(chǎn)流程，簡化工序，推動啤酒生產(chǎn)的技術(shù)革新。116第116頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）食品的抗菌和防腐保鮮乳酸菌遺傳特性的改造應(yīng)用：抗藥基因風(fēng)味物質(zhì)基因產(chǎn)酶基因耐氧基因產(chǎn)細(xì)菌素基因

··············P35-36。117第117頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月抗藥基因目前，利用乳酸菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品很多，如酸奶、干酪、酸奶油、酸乳酒等，已應(yīng)用的乳酸菌基本上為野生菌株。有的野生菌株本身就抗多種抗生素，因而在其使用過程中，抗藥基因?qū)⒂锌赡芤越Y(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等形式在微生物菌群之間相互傳遞而發(fā)生擴(kuò)散。利用基因工程技術(shù)可選育無耐藥基因的菌株，當(dāng)然也可去除生產(chǎn)中已應(yīng)用菌株中含有的耐藥質(zhì)粒，從而保證食品用乳酸菌和活菌制劑中菌株的安全性。118第118頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月風(fēng)味物質(zhì)基因乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中與風(fēng)味有關(guān)的物質(zhì)主要有乳酸、乙醛、丁二酮、3-羥基-2-丁酮、丙酮和丁酮等。可以通過基因工程選育風(fēng)味物質(zhì)含量高的乳酸菌菌株。119第119頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)酶基因乳酸菌不僅具有一般微生物所產(chǎn)生的酶系，而且還可以產(chǎn)生一些特殊的酶系，如產(chǎn)生有機(jī)酸的酶系、合成多糖的酶系、降低膽固醇的酶系、控制內(nèi)毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各種維生素的酶系和分解膽酸的酶系等，從而賦予乳酸菌特殊的生理功能。若通過基因工程克隆這些酶系，然后導(dǎo)入到生產(chǎn)干酪、酸奶等發(fā)酵乳制品生產(chǎn)用乳酸菌菌株中，將會促進(jìn)和加速這些產(chǎn)品的成熟。另外，把膽固醇氧化酶基因轉(zhuǎn)到乳酸桿菌中，可降低乳中膽固醇含量。120第120頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月耐氧相關(guān)基因乳酸菌大多數(shù)屬于厭氧菌，這給實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)帶來諸多不便。從遺傳學(xué)和生化角度看，厭氧菌或兼性厭氧菌幾乎沒有超氧化物歧化酶基因和過氧化氫酶基因或者說其活性很小。若通過生物工程改變超氧化物歧化酶的調(diào)控基因則有可能提高其耐氧活性。當(dāng)然將外源SOD基因和過氧化氫酶基因轉(zhuǎn)入?yún)捬蹙校部梢云鸬教岣邊捬蹙图嫘詤捬蹙鷮ρ醯牡挚鼓芰Α?21第121頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)細(xì)菌素基因乳酸菌代謝不僅可以產(chǎn)生有機(jī)酸等產(chǎn)物，還可以產(chǎn)生多種抑制性物質(zhì)如細(xì)菌素、CO2等，具有作為食品防腐劑的應(yīng)用潛力，若通過生物工程技術(shù)將細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因克隆到生產(chǎn)用菌株中，不僅可以使不產(chǎn)細(xì)菌素的菌株獲得產(chǎn)產(chǎn)細(xì)菌素的能力，而且為人工合成大量的細(xì)菌素提供了可能。122第122頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）食品級酶制劑生產(chǎn)菌的改良利用基因工程技術(shù)不但可以成倍地提高酶的活力，而且還可以將生物酶基因克隆到微生物中，構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)酶。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已有70％的工業(yè)用酶是用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的。轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、品質(zhì)均一、穩(wěn)定性好、價(jià)格低等。123第123頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月凝乳酶的基因改造應(yīng)用：凝乳酶是第一個(gè)應(yīng)用基因工程技術(shù)把小牛胃中的凝乳酶基因轉(zhuǎn)移至細(xì)菌或真核微生物生產(chǎn)的一種酶。1990年美國FDA已批準(zhǔn)在干酪生產(chǎn)中使用，目前3/4干酪為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，大大緩解了凝乳酶供應(yīng)不足的狀況。耐熱α-淀粉酶：溶菌酶：葡萄糖氧化酶：················第124頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）保健食品功效成分的生產(chǎn)維生素C：采用基因重組構(gòu)建菌株高表達(dá)的單鏈蛋白2,5-DKG還原酶，加速催化維生素C的前提2-KLG的生成，縮短維生素C的生產(chǎn)周期。核黃素（VB2）超氧化物歧化酶（SOD）二十二碳六烯酸（DHA）················125第125頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月（6）食品微生物的快速檢測食源性微生物污染的快速檢測：李斯特菌沙門氏菌致瀉性大腸桿菌其他致病菌······126第126頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月二、轉(zhuǎn)基因動物食品涉及類型：家畜家禽：牛、豬、羊、兔、雞等；水生生物：各種食用魚類昆蟲：食用家蠶主要應(yīng)用：改變家畜生成速度；改善乳產(chǎn)品的營養(yǎng)組分，特別針對嬰幼兒通過生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清蛋白等。127第127頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月為了提高乳牛的產(chǎn)奶量，可將采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的牛生長激素(BST)注射到母牛體內(nèi)，既可達(dá)到提高母牛產(chǎn)奶量的目的，又不影響奶的質(zhì)量。同樣，為了提高豬的瘦肉含量或降低豬脂肪含量，可將采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的豬生長激素，注射至豬體內(nèi)，便可使豬瘦肉型化，有利于改善肉食品質(zhì)。128第128頁，課件共140頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)基因植物食品定義：由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的食物或利用轉(zhuǎn)基因植物為原料生產(chǎn)的食品或食品添加劑。主要類型：大豆：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕玉米：玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉油菜：油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕棉花種子