抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝培訓(xùn)課件

抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

抗生素概述鏈霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝（略）青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝1237/22/20232抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素的分類2

抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)3

抗生素生產(chǎn)的技術(shù)需求4抗生素的定義與命名17/22/20233抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝早期定義現(xiàn)代定義抗生素是一種微生物產(chǎn)生的，能抑制或干擾其他微生物生長(zhǎng)，甚至殺死它種微生物的一種化學(xué)物質(zhì)。抗生素是微生物、植物和動(dòng)物產(chǎn)生的（或化學(xué)合成獲得的），能夠在低微濃度下有選擇地抑制或殺滅它種生物的有機(jī)物質(zhì)。7/22/20234抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。如，具有四環(huán)素結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)物質(zhì)為四環(huán)素類抗生素。根據(jù)來(lái)源生物的屬名。如，來(lái)源于青霉菌的抗生素為青霉素；以一些習(xí)慣性俗名、發(fā)現(xiàn)的地名等命名。如，正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等；命名原則7/22/20235抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素的分類2

抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)3

抗生素生產(chǎn)的技術(shù)需求4抗生素的定義與命名17/22/20236抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝生物來(lái)源作用機(jī)理作用對(duì)象類別放線菌：鏈霉菌抗生素舉例真菌：青霉菌細(xì)菌：多黏桿菌鏈霉菌青霉菌多粘菌素抑制細(xì)胞壁合成影響細(xì)胞膜的功能抑制蛋白質(zhì)的合成青霉素多烯類抗生素四環(huán)素廣譜抗菌抗革蘭陽(yáng)性菌抗真菌氨芐青霉素青霉素放線菌酮7/22/20237抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝生物合成途徑應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)工藝類別氨基酸或肽類衍生物抗生素舉例糖苷類衍生物乙酸或丙酸衍生物青霉素，環(huán)絲氨酸鏈霉素，紅霉素四環(huán)素，灰黃霉素人用抗生素農(nóng)用抗生素食品保藏、物品防腐和霉變頭孢霉素，羧芐青霉素井岡霉素，春雷霉素金霉素，放線菌酮微生物發(fā)酵（生物合成）化學(xué)全合成半合成青霉素，鏈霉素氯霉素，磷霉素氨芐青霉素，頭孢菌素7/22/20238抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素的分類2

抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)3

抗生素生產(chǎn)的技術(shù)需求4抗生素的定義與命名17/22/20239抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝分為9類，化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了理化性質(zhì)、作用機(jī)制及其療效7/22/202310抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素的分類2

抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)3

抗生素生產(chǎn)的技術(shù)需求4抗生素的定義與命名17/22/202311抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝即生物合成途徑，目前大多數(shù)抗生素品種采用發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特點(diǎn)是成本較低，周期較長(zhǎng)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的抗生素可采用此途徑如氯霉素和磷霉素利用化學(xué)方法修飾改良生物合成的抗生素，擴(kuò)大抗菌譜提高療效和降低毒副作用等，獲得新抗生素，如半合成青霉素、半合成頭孢菌素等工業(yè)化生產(chǎn)途徑微生物發(fā)酵化學(xué)全合成化學(xué)半合成7/22/202312抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝微生物合成抗生素上游：菌種保存、選育、孢子及種子制備發(fā)酵——適宜的培養(yǎng)基、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽（微量元素）、前體、消沫劑；流加碳源和氮源、流加氨水調(diào)節(jié)PH、好氧培養(yǎng):通入無(wú)菌氧氣

下游：提取

預(yù)處理過(guò)濾進(jìn)一步提?。ㄝ腿　㈦x子交換、沉淀法、吸附法等）結(jié)晶干燥純品7/22/202313抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

抗生素概述鏈霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝（略）青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝1237/22/202314抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1青霉素的研究2青霉素生產(chǎn)菌的特性3青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程4青霉菌分離純化工藝過(guò)程7/22/202315抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝主要作用于細(xì)胞壁的肽多糖合成的第三階段。線性肽多糖在轉(zhuǎn)肽酶的催化下進(jìn)行交聯(lián)，肽多糖鏈之間每?jī)蓷l肽鏈結(jié)合時(shí)均釋放出一個(gè)D-丙氨酸。青霉素與肽多糖的D-丙胺酰-D-丙氨酸二肽相似，競(jìng)爭(zhēng)性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，是轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)，從而起到抑菌的作用。因此，青霉素對(duì)生長(zhǎng)中的細(xì)胞有效，對(duì)靜止細(xì)胞無(wú)效。是發(fā)現(xiàn)最早、最卓越的一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，其內(nèi)酰胺環(huán)是重要的抗菌活性結(jié)構(gòu)。青霉素是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品，中國(guó)為青霉素生產(chǎn)大國(guó)，青霉素的產(chǎn)量已占世界產(chǎn)量的近70%。作用機(jī)理青霉素7/22/202316抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。（2）各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。7/22/202317抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素可看成是6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic6APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素。其中主要是青霉素G。分子結(jié)構(gòu)及其衍生物7/22/202318抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝側(cè)鏈取代基R化學(xué)名稱通用名稱HO-C6H4-CH2-對(duì)羥基芐青霉素青霉素XC6H5-CH2-芐基青霉素青霉素GCH3-CH2-CH=CH-CH-2-戊烯基青霉素青霉素FCH3-(CH2)3-CH2-戊青霉素青霉素FCH3-(CH2)5-CH2-庚青霉素青霉素KCH2=CH-CH2-S-CH2-丙烯巰甲基青霉素青霉素OC6H5O-CH2-苯氧甲基青霉素青霉素V7/22/202319抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素是有機(jī)酸，易溶于醇、酸、醚、酯類。青霉素在水中溶解度很小，而且很快失去活性。青霉素G的pK值為2.76，能與無(wú)機(jī)或有機(jī)堿成鹽。青霉素鹽極易溶于水，幾乎不溶于乙醚、氯仿、乙酸戊酯等，易溶于低級(jí)醇，略溶于乙醇、丁醇、乙酸乙酯等，而水的存在會(huì)加速溶解。青霉素鹽的穩(wěn)定性與含水量和純度相關(guān)，干燥純品很穩(wěn)定，對(duì)熱也很穩(wěn)定，可進(jìn)行干熱滅菌。但在水中很不穩(wěn)定，隨溫度和PH影響很大，低溫下穩(wěn)定，而高溫下易失活。一般在PH5~7時(shí)較穩(wěn)定，PH在6~6.5最穩(wěn)定。青霉素遇酸、堿和金屬離子都很不穩(wěn)定，發(fā)生開環(huán)、重排和降解等反應(yīng)，內(nèi)酯胺環(huán)破壞后，青霉素失去活性。青霉素G類鹽的理化性質(zhì)交表（書P172）7/22/202320抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1青霉素的研究2青霉素生產(chǎn)菌的特性3青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程4青霉菌分離純化工藝過(guò)程7/22/202321抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素生產(chǎn)菌的特性生物學(xué)特性：產(chǎn)黃青霉按孢子形態(tài)分為：綠色孢子和黃色孢子深層培養(yǎng)菌絲形態(tài)：球狀和絲狀兩種生產(chǎn)上采用綠色絲狀菌株菌落：平坦或皺褶，圓形青霉穗:分生孢子，排列呈鏈狀，似毛筆7/22/202322抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)過(guò)程第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：脂肪包涵體，儲(chǔ)藏物，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：個(gè)別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無(wú)顆粒，釋放氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。7/22/202323抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝在規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體為適宜種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過(guò)工藝措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)過(guò)程7/22/202324抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1青霉素的研究2青霉素生產(chǎn)菌的特性3青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程4青霉菌分離純化工藝過(guò)程7/22/202325抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝瓊脂斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐過(guò)濾萃取脫色結(jié)晶干燥冷凍干燥孢子工業(yè)鹽成品青霉素生產(chǎn)工藝流程7/22/202326抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過(guò)程1、生產(chǎn)孢子制備斜面孢子：將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的斜面固體培養(yǎng)基活化再傳斜面進(jìn)行培養(yǎng)米孢子：接入到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天（25℃，相對(duì)濕度50%）注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。7/22/202327抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝2、種子罐培養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。pH自然，空氣流量1：3（體積比）；300-350r/min；溫度（27±1）℃,40-50h,菌絲濃度達(dá)40%以上。二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿等。pH自然，空氣流量：1:（1-1.5）；250-280r/min；（25±1）℃。14h，菌絲濃度40%以上，殘?zhí)?.0%左右，無(wú)雜菌，為合格種子。7/22/202328抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；接種量12%-15％培養(yǎng)基：花生餅粉（高溫），麩質(zhì)粉，玉米漿，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫酸鈉，硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消沫劑，CaCO3等參數(shù)條件：

通氣量：0.7-1.8；150-200r/min；

前60小時(shí):pH5.7-6.3，26℃；

60小時(shí)后:pH6.3-6.6,24℃。7/22/202329抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

碳源的選擇碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA(6-氨基青霉烷)結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量控制糖的流加。葡萄糖的流加，波動(dòng)范圍較窄，濃度過(guò)低使抗生素合成速度減慢或停止，過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)窃?.6％左右，pH開始升高時(shí)流加糖。（一）培養(yǎng)基7/22/202331抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝氮源的選擇玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素補(bǔ)氮。無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30ug/ml以下。7/22/202332抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝添加前體時(shí)期：合成階段種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。策略：低濃度流加控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。7/22/202333抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉菌生長(zhǎng)適宜溫度30℃，合成適宜溫度25℃20℃，青霉素破壞少，但周期很長(zhǎng)變溫控制，不同階段不同溫度生長(zhǎng)階段：較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間生產(chǎn)階段：適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成前期控制在25-26℃左右，后期降溫控制24℃（二）溫度7/22/202334抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過(guò)7.0在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解pH下降：流加CaCO3、通氨水調(diào)節(jié)或提高通氣量pH上升：流加糖或天然油脂（三）PH7/22/202335抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝＜30％飽和氧濃度，產(chǎn)率急劇下降＜10％飽和氧濃度，造成不可逆的損害臨界溶氧濃度：30％通氣比：1：0.8VVM適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧根據(jù)各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:（四）溶解氧7/22/202336抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝臨界菌體濃度：溶解氧速率和氧消耗速率達(dá)到平衡時(shí)的菌體濃度。>此濃度，則供氧不足，溶解氧下降，發(fā)酵產(chǎn)率下降。發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃15%-20%,菌干重3%-5%左右（五）菌體濃度7/22/202337抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝天然油脂：玉米油化學(xué)消沫劑：泡敵策略：少量多次注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。（六）消沫7/22/202338抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1青霉素的研究2青霉素生產(chǎn)菌的特性3青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程4青霉菌分離純化工藝過(guò)程7/22/202339抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝分離純化工藝過(guò)程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性

在發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過(guò)程條件溫和、快速，防止降解。7/22/202340抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素分離純化工藝過(guò)程預(yù)處理過(guò)濾萃取脫色結(jié)晶7/22/202341抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：僅含百分之幾含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、金屬離子、代謝產(chǎn)物等目的：濃縮青霉素，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，便于后續(xù)的分離純化過(guò)程預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白（1）預(yù)處理7/22/202342抗生素發(fā)酵生產(chǎn)