基因工程疫苗

第六章基因工程疫苗

第一節(jié)疫苗概述一、疫苗的起源與發(fā)展疫苗的起源可以追溯到我國古代。早在4世紀初，東晉葛洪所著《肘后方》中，已有關于防治狂犬病的記載：“殺所咬犬，取腦敷之，后不復發(fā)”。在宋真宗時代（公元1000年左右）宰相王達之子患了天花，四處請醫(yī)無效，最后請來了峨眉山的道人，取其患處的結痂，處理后進行自體接種而治愈，這當是最早的自身免疫治療（self-Vaccine）

。

逐漸發(fā)展成了預防天花的人痘接種法，即從感染天花后的恢復期病人或癥狀比較輕的病人身上，挑取水泡、膿皰和痘痂內容物并保存1個月左右待其干燥，然后將其研磨成粉末，給健康人的鼻腔吸入，以預防天花，取得了很好的保護效果。這是人類史上最早使用疫苗來預防疾病的記錄，較英國醫(yī)生琴納（Jenner）發(fā)明牛痘苗早了幾百年。

15世紀中期我國的人痘苗接種法傳至中東，后經改革進行皮下接種。1721年英駐土耳其的大使夫人，將此法又傳至英與歐洲各國。人痘的發(fā)明是中國人民對世界醫(yī)學的一大貢獻。2000年，美國疾病控制與預防中心（CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC）出版了《疫苗可預防疾病的流行病學與預防學》第6版，在這本被譽為疫苗學權威手冊首頁的“疫苗接種的里程碑”中，第一項即是“12世紀中國開始用人痘接種預防天花”（見表6-1）。這是對中國首先開始使用人痘接種預防天花是最早的免疫接種形式的肯定。

表5-1疫苗發(fā)展史上的里程碑事件

時間事件12世紀中國開始用人逗接種預防天花1721年人逗接種傳入英國1796年E.Jenner為JamesPhipps接種牛痘，疫苗接種正式開始1870L.Pasteur發(fā)明了第一個細菌減毒活疫苗——雞霍亂疫苗1884年L.Pasteur發(fā)明了第一個病毒減毒活疫苗——狂犬病疫苗1885年L.Pasteu第一次把狂犬病疫苗接種于人體1901年VonBehring發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，獲得第一個醫(yī)學諾貝爾獎1909年Smith發(fā)明了滅活白喉毒素的方法1909年Calmette和Guerin發(fā)明了第一個用于人的細菌減毒活疫苗BCG1933年GoodPasture發(fā)明了雞胚病毒培養(yǎng)法1949年Enders及其同事從人細胞系中分離出脊髓灰質炎Ⅱ型Lancing株1954年Enders分離出麻疹病毒1955年脊髓灰質炎滅活疫苗獲準生產時間事件1961年人二倍體細胞株建立1963年麻疹疫苗獲準生產三價脊髓灰質炎疫苗獲準生產1966年世界衛(wèi)生聯(lián)盟呼吁全球消滅天花1977年索馬里發(fā)現(xiàn)最后一例本土天花1979年美國報道最后一例野毒傳播型脊髓灰質炎1986年第一個重組疫苗——重組乙型肝炎疫苗獲準生產1989年推薦使用二劑型麻疹疫苗1990年第一個多糖結合疫苗——B型流感嗜血桿菌疫苗獲準生產1991年西半球報道最后一例野毒株脊髓灰質炎病例乙型肝炎免疫納入全球計劃免疫1994年美國消滅脊髓灰質炎得到證實1995年水痘疫苗獲準生產1996年用于嬰兒的無細胞型百日咳疫苗獲準生產1997年推薦進行掃蕩式脊髓灰質炎免疫1999年推薦單一使用脊髓灰質炎滅活疫苗2000年用于嬰兒的結合肺炎球菌疫苗獲準生產引自：CDC：EpidemiologyandPreventionofVaccine-preventableDisease.6Edition，200017965.14英國鄉(xiāng)村醫(yī)生愛德華·琴納（EdwardJenner）進行了人類歷史上的第一次疫苗接種試驗。Jenner從一位感染了牛痘的年輕擠奶農婦的手上挑取了痘苗接種到一名8歲男孩的手臂上。經過幾個月的嚴密觀察，發(fā)現(xiàn)小男孩獲得了免疫保護，一直沒有感染天花。1798年9月，Jenner發(fā)表了接種“牛痘”預防天花的論文，雖然當時全然不知天花是由天花病毒感染所致，但這一劃時代的發(fā)明，開創(chuàng)了人工自動免疫的先河。隨后，種痘技術傳遍了歐洲，后又傳到北美和亞洲。為紀念Jenner的這一偉大貢獻，巴斯德（Pasteur）將疫苗稱為Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。由于長期和廣泛地使用牛痘苗，全世界從1977年以后再也沒有發(fā)現(xiàn)過天花病人。世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）于1979年10月26日莊嚴宣布，天花已在全球絕跡。這是人類歷史上第一個使用疫苗消滅的傳染病。19世紀70年代，法國科學家路易斯·巴斯德（LouisPasteur）有關減毒雞霍亂菌的研究，是繼琴納之后的重大進步。他認為使用減毒的病原體來預防其導致的疾病，比使用相關的動物病原體來預防人類疾病理當更加有效。巴斯德建立了現(xiàn)代意義上的預防接種，即通過實驗室內研制的疫苗來預防傳染病。隨后的羊炭疽減毒活疫苗的試驗成功，尤其是1885年首次在人體使用減毒狂犬病疫苗的成功，標志人類進入了一個預防接種的科學新紀元?；诎踩颍缴a的均為狂犬病滅活疫苗，質量上也在不斷的改進。Pasteur在疫苗研制領域的先鋒作用和卓越貢獻引起了第一次疫苗革命。到19世紀末，人類在疫苗學領域里已經取得了輝煌的成就，包括2個人用病毒減毒活疫苗（琴納的牛痘，巴斯德的狂犬?。?個人用細菌滅活疫苗（美國Salmon和Smith、法國Chamberlai和Roux的傷寒、霍亂和鼠疫），以及疫苗學的一些基礎概念，如Metchnikoff的的細胞免疫（1884年），Ehrlich的受體理論（1897年）及毒素-抗毒素作用。進入20世紀前30年，疫苗學在三個方面取得了重大進展：首先，法國科學家Calmette和Guerin在1906年從牛體分離到1株結核菌，經過13年在牛膽汁中傳遞230代，獲得1株減毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所謂卡介苗（BCG）。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon應用化學滅活方法獲得白喉和破傷風類毒素并研制成疫苗。第三，WilsonSmith和ThomasFrancis分別在禽胚中研制成功2種滅活甲型流行性感冒（流感）疫苗。二次大戰(zhàn)后，疫苗研究進入了突飛猛進的發(fā)展階段。波士頓的Enders及其同事發(fā)展了病毒的體外細胞培養(yǎng)技術，促進了多種減毒和滅活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3價滅活脊髓灰質炎（脊灰）疫苗（IPV），后有Sabin的3價減毒脊灰疫苗（OPV），為人類渴望在地球上消滅脊灰提供了有力武器。同一時期還研制了在雞胚細胞中培養(yǎng)減毒的麻疹疫苗。60年代研制了在雞胚中減毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在細胞中培養(yǎng)的風疹疫苗。細菌疫苗方面，70年代細菌夾膜多糖的純化技術促進了多個侵襲性細菌疫苗的研制成功。同一時期的病毒蛋白純化技術也促進了血源性乙型病毒性肝炎（乙肝）疫苗的研制成功。20世紀80年代，現(xiàn)代分子技術的應用推動了又一代疫苗的研制，引發(fā)了疫苗發(fā)展史上的第二次革命，其首要成果是基因重組乙肝疫苗，為人類在地球上消除乙肝提供了希望。與此同時，化學、生物化學、遺傳學和免疫學的發(fā)展在很大程度上為新疫苗的研制和舊疫苗的改進提供了新技術和新方法（表5-2）。表5-2新技術對疫苗研制和開發(fā)的作用及影響

學科領域生物技術作用和影響遺傳學基因工程和DNA重組（包括基因克隆和表達，DNA測序，DNA合成，核酸內切酶和工具酶，PCR，全基因圖譜）抗原鑒定和抗原分離測定抗原的可變性蛋白質抗原的基因工程基因突變和減毒重組微生物作為載體化學多肽合成鑒定抗原表位研制多肽疫苗蛋白質結構計數(shù)及估測T和B細胞表位糖結構多糖疫苗基礎研究佐劑，多糖和蛋白質偶聯(lián)疫苗免疫學單克隆抗體抗原鑒定和抗原分離鑒定抗原表位抗同種異型模擬非蛋白質表位免疫調控新型佐劑基礎研究細胞和分子免疫機理粘膜免疫至今已有30余種疫苗成功的用于人類疾病的預防（表5-3）。其中一半以上是病毒疫苗。如天花（poxvirus）、小兒麻痹（poliovirus）、麻疹（Measles）等曾嚴重危害人類生命與健康的疾病的流行得到了有效的控制。其中天花已被根除，創(chuàng)造了使用疫苗在自然界中徹底消滅一種病原微生物的醫(yī)學奇跡。人類消滅脊髓灰質炎的目標也即將實現(xiàn)。表6-3人用疫苗發(fā)展年表應用年份疾病名稱疫苗類型1721天花“人痘”活天花病毒1796天花“天然減毒”痘苗病毒1885狂犬病“不同程度”減毒的滅活病毒1936黃熱病活減毒病毒1936流感滅活全病毒1943流感滅活完整（whole）病毒1955小兒麻痹滅活病毒1957狂犬病滅活病毒、鴨胚培養(yǎng)1961小兒麻痹活減毒病毒1963麻疹滅活病毒和減毒活病毒1967腮腺炎活減毒病毒1969風疹活減毒病毒表6-3人用疫苗發(fā)展年表應用年份疾病名稱疫苗類型1972流腦純化多糖A和C型1974日本腦炎（乙腦）滅活病毒1976狂犬病滅活病毒、人二倍體細胞培養(yǎng)1981乙型肝炎滅活、血源苗1982腦膜炎球菌腦膜炎純化A、C、Y、W135型多糖1983日本腦炎（乙腦）活減毒病毒1983水痘活減毒病毒1986乙型肝炎基因重組蛋白質疫苗1991甲型肝炎活減毒病毒和滅活病毒1998輪狀病毒腹瀉活減毒病毒1998回歸熱純化蛋白質疫苗我國自1919年開始建立專門的機構（中央防疫處，北京生物制品研究所前身）從事生物制品的研究、生產，這是我國第一所生物制品研究所。建國后，我國政府重新組建和新建了北京、上海、武漢、長春、蘭州、成都等六個生物制品研究所。中國現(xiàn)有疫苗產品生產企業(yè)約30家，是世界上疫苗產品生產企業(yè)最多的國家（表5-4）。中國的疫苗產品年產量已經超過10億個劑量單位，疫苗的種類和數(shù)量也達到世界之最，其中用于預防乙肝、脊髓灰質炎、麻疹、百日咳、白喉、破傷風的兒科常見病的疫苗生產量達到5億人份，已經全部實現(xiàn)計劃免疫接種。中國生產的疫苗產品已經能夠滿足防病、滅病的需要。表6-4中國主要疫苗種類和生產廠家

種類制品名稱用途生產廠家病毒類重組酵母基因工程乙肝疫苗用于預防所有已知亞型的乙肝病毒的感染。北京天壇生物、深圳康泰重組（CHO）乙型肝炎疫苗預防乙型肝炎病毒感染長春所、蘭州所、華北制藥甲型肝炎純化滅活疫苗（VAQTA）VAQTA適用于接觸前的主動免疫，以預防甲型肝炎病毒引起的肝炎，但不能預防由非甲型肝炎病毒引起的肝炎。首次免疫應在預計接觸前至少2周進行。巴斯德-梅里厄-康納公司、北京科興甲型肝炎減毒疫苗用于預防甲型肝炎史克必成公司、長春所、長春高新種類制品名稱用途生產廠家風疹減毒活疫苗年齡為8個月以上的風疹易感者巴斯德-梅里厄-康納公司、蘭州所、天壇生物、上海所麻疹減毒活疫苗預防麻疹病蘭州所、長春所、上海所森林腦炎滅活疫苗用于預防森林腦炎長春所乙型腦炎滅活疫苗本疫苗免疫接種后，刺激機體產生抗乙型腦炎病毒的免疫力，用于預防乙型腦炎。蘭州所、長春所、天壇生物、上海所Ⅰ型腎綜合征出血熱純化疫苗預防流行性出血熱蘭州所、上海所Ⅱ型腎綜合征出血熱純化疫苗預防Ⅱ型出血熱長春所流行性感冒滅活疫苗6歲以上所有希望預防流感的健康人群巴斯德-梅里厄-康納公司、史克必成公司、蘭州所、長春所、長春高新腮腺炎減毒活疫苗8月齡以上的腮腺炎易感者蘭州所、上海所種類制品名稱用途生產廠家口服脊髓灰質炎減毒活疫苗預防脊髓灰質炎天壇生物口服輪狀病毒活疫苗預防小兒秋季腹瀉蘭州所水痘減毒活疫苗12月齡以上的水痘易感者長春生物制品研究所、史克必成公司、長春所、上海所人用狂犬病純化疫苗用于預防狂犬病巴斯德-梅里厄-康納公司、蘭州所、長春所、成都所黃熱減毒活疫苗預防黃熱病天壇生物聯(lián)合疫苗吸附白喉、破傷風、百日咳和脊髓灰質炎疫苗該聯(lián)合疫苗適用于兒童預防白喉、破傷風、百日咳和脊髓灰質炎的基礎免疫及加強免疫。巴斯德—梅里厄—康納公司麻疹、流行性腮腺炎和風疹疫苗預防麻疹、流行性腮腺炎、風疹默沙東公司、史克必成公司甲乙肝聯(lián)合疫苗預防甲肝和乙肝史克必成公司、北京科興二、疫苗與基因工程疫苗

傳統(tǒng)疫苗（TraditionalVaccine）用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑或者用理化方法將病原微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動免疫以保護人或動物產生免疫力，這些制劑被稱為疫苗（多用于預防），即疫苗是由病原體制成的。國內常將細菌制作的人工主動免疫生物制品稱為菌苗。將病毒（Virus）、立克次氏體（Rickettia）、螺旋體（Spiralcoil）等微生物制成的生物制品稱為疫苗。現(xiàn)在國際上一般將細菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗（vaccine）?；蚬こ桃呙纾荷鲜霆M義的疫苗被稱做傳統(tǒng)疫苗（traditionalvaccine），即完整的病原體為主制成的疫苗；而基因工程疫苗則屬于新一代疫苗（NewgenerationVaccine）或高技術疫苗范疇（High-techVaccine）。主要包括基因工程亞單位疫苗、基因工程載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，廣義的還包括遺傳重組疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型抗體疫苗以及微膠囊可控緩釋疫苗等?，F(xiàn)代疫苗（Modernvaccine）：是一種利用現(xiàn)代分子生物學技術使用Ag通過誘發(fā)機體產生特異性免疫反應以予防和治療疾病或達到某種特定的醫(yī)學目的生物制劑。

三、傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的區(qū)別：傳統(tǒng)疫苗①疫苗的研制則主要是通過人體實驗從經驗與失敗中獲得。②20世紀以來，隨著病原學、流行病學、免疫學，特別是病毒組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，大量傳統(tǒng)疫苗相繼問世。③免疫學的進展，使人們可以通過是否產生中和抗體判定疫苗成功與否。幾乎所有免疫保護機制明確，可以產生中和抗體，又易于培養(yǎng)的疫苗都已獲得成功。甚至一些新出現(xiàn)的疾病，主要具備上述特點，也可以使用傳統(tǒng)疫苗技術迅速研制成功（表5-5）。④對于免疫保護機制不明確，有潛在致癌性或免疫病理作用，以及病原不能或難于培養(yǎng)的疫苗，使用傳統(tǒng)疫苗技術就很難研制成功。新型疫苗①新型疫苗則是在分子生物、分子免疫學、蛋白化學以及相應的生物高技術基礎上發(fā)展起來的（Woodrow，1997）。②重組DNA技術包括促進了疫苗生產技術的發(fā)展。

③從現(xiàn)代的觀點來看，我們可以把疫苗定義為：一種使用抗原通過誘發(fā)機體產生特異免疫反應以預防和治療疾病或達到特定醫(yī)學目的的生物制劑。④目前新型疫苗的研究主要集中在改進傳統(tǒng)疫苗和研制傳統(tǒng)技術不能解決的新疫苗兩個方面，包括腫瘤疫苗、避孕疫苗及其它非感染性疾病疫苗的研究，其中發(fā)展治療性疫苗已成為新型疫苗研究的重要組成部分。疫苗類型國內外生產狀況國內國外1小兒麻痹（OPV）減毒活疫苗（I-III型聯(lián)合）+-小兒麻痹（IVP）滅活疫苗（I-III型聯(lián)合）+-2麻疹減毒活疫苗++3卡介苗（BCG）減毒活疫苗++4白喉-百日咳-破傷風（DPT）亞單位疫苗（聯(lián)合）++亞單位疫苗（基因工程P）-+5

乙型肝炎亞單位疫苗（血源）++亞單位疫苗（基因工程CHO）+（S）+（S2）亞單位疫苗（基因工程酵母）+（引進）+6乙腦減毒活疫苗+-滅活疫苗++7流腦亞單位疫苗（多糖）++8甲肝減毒活疫苗++滅活疫苗-+9流感滅活疫苗++減毒活疫苗（遺傳重配）-+10狂犬滅活疫苗++11風疹減毒活疫苗++12腮腺炎減毒活疫苗++麻疹-風疹-腮腺炎（MMR）減毒活疫苗（三種聯(lián)合）-+13出血熱滅活疫苗++14腺病毒（Ad4，Ad7）減毒活疫苗-+15水痘減毒活疫苗-+16黃熱病減毒活疫苗++17輪狀病毒腹瀉減毒活疫苗（人猴遺傳重配）-+減毒活疫苗（人羊遺傳重配）+-18傷寒滅活疫苗++減毒活疫苗（Ty21a）-+19鉤端螺旋體滅活疫苗+-20霍亂亞單位+滅活（CTB+WC）-+亞單位+滅活（基因工程CTB+WC）++減毒活疫苗（基因工程CBV-HgR）-+21鼠疫減毒活疫苗++22斑疹傷寒滅活疫苗++23布氏桿菌減毒活疫苗++24炭疽桿菌減毒活疫苗++25痢疾減毒活疫苗（基因工程FS）+-26鏈球菌肺炎亞單位疫苗（多糖）-+27噬血桿菌流感亞單位疫苗（多糖）-+28痘苗（天花）減毒活疫苗+*+*注：“+”為已投入生產，“-”為未生產，“*”為已停止生產第二節(jié)病毒疫苗的種類一、傳統(tǒng)病毒疫苗

又稱常規(guī)疫苗或第一代疫苗，是長期以來用于傳染病預防的主要生物制品。1、滅活疫苗（deadVaccine）

滅活疫苗又稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結合相應的佐劑而制成的疫苗。疫苗液中除含有滅活的病毒顆粒外，還含有細胞成分和培養(yǎng)病毒時加入的牛血清等蛋白類物質，多次接種疫苗容易發(fā)生過敏反應。優(yōu)點制造工藝簡單免疫原性的穩(wěn)定性高易于制備多價疫苗缺點：1）需要嚴格的滅活操作，保證疫苗中不含有滅活不完全的顆粒。2）滅活疫苗所提供的免疫力較短暫，為完成免疫程序，需要進行多次接種，由于機體反復接受疫苗中的異性蛋白質的刺激，而可能出現(xiàn)不良的過敏反應。3）有些滅活疫苗，如早年制備的麻疹滅活疫苗，可使有些受接種者在以后自然接觸麻疹病毒時，引起嚴重的麻疹感染過敏性反應。4）滅活疫苗雖可刺激機體產生IgM和IgG抗體，但有時卻得不到滿意的保護效果。2、減毒活疫苗（attenuatedvaccine）減毒活疫苗又稱弱毒疫苗，是指將微生物的自然強毒株通過物理、化學和生物學的方法，連續(xù)傳代，使其對原宿主喪失致病力，或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株制備的疫苗就叫減毒活疫苗。當前使用的病毒疫苗多數(shù)是減毒活疫苗?；钜呙缇哂锌烧T發(fā)全面的免疫應答反應（體液免疫和細胞免疫）、免疫力持久等優(yōu)點。常用的減毒方法有以下幾種：1）體外減毒即體外連續(xù)傳代減毒。在異源宿主中連續(xù)傳代；在單一宿主中反復連續(xù)傳代。2）冷適應篩選溫度可以改變病毒的特性，得到冷適應株。病毒冷適應株常伴有毒力減弱和各種特征性標志。冷適應篩選穩(wěn)定的減毒突變株是在傳統(tǒng)疫苗設計中較早采用的方法，而且也是最為行之有效的思路。減毒活疫苗與滅活疫苗各有優(yōu)缺點。前者優(yōu)于后者。減毒活疫苗可使機體產生亞臨床感染，特別當以自然途徑，如口服或噴鼻免疫時，可產生廣譜的免疫應答，即除循環(huán)性抗體IgM和IgG外，在病毒侵入的門戶如呼吸道和消化道也可誘生局部抗體IgA。

3、亞單位疫苗（subunitvaccine）亞單位疫苗是指提取或合成細菌、病毒外殼的特殊蛋白結構，即抗原決定簇制成的疫苗，這類疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物質，故稱亞單位疫苗。亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白，因而能消除病毒（或細菌）的許多無關抗原決定簇和粗制或半提純的病毒（或細菌）制劑誘發(fā)的不良反應。表5-6滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗三類疫苗的比較滅活疫苗減毒活疫苗亞單位疫苗制備方法通過化學或物理方法使病原體失活通過非正常培養(yǎng)選擇減毒株或無毒株以化學方法獲得病原體的某些具有免疫原性的成分免疫機理病原體失去毒力但保持免疫原性，接種后產生特異抗體或致敏淋巴細胞接種后病原體在體內有一定生長繁殖能力，類似隱性感染，產生細胞、體液和局部免疫接種后能刺激機體產生特異性免疫疫苗穩(wěn)定性相對穩(wěn)定相對不穩(wěn)定穩(wěn)定毒力回升不可能有可能不可能免疫接種多次免疫接種一般為一次性多次免疫接種安全性較安全對免疫缺陷者有危險安全性好常用疫苗乙腦、脊髓灰質炎滅活疫苗麻疹、脊髓灰質炎減毒活疫苗白喉、破傷風類毒素，A群腦膜炎球菌多糖疫苗二、新一代病毒疫苗新一代病毒疫苗（新型疫苗）主要指利用基因工程技術研制的疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙?、基因工程載體疫苗、核酸疫苗、基缺失活疫苗，通常也習慣地將遺傳重組疫苗、合成肽疫苗和抗獨特型抗體疫苗包括在新型疫苗范疇。

1.NewGenerationvaccineorHigh-techVaccine（高技術疫苗）①基因工程亞單位疫苗（geneengineeringsubunitvaccine)②基因工程載體疫苗(geneengineeringvectorvaccine)③核酸疫苗(nucleicacidvaccine)④基因缺失活疫苗(genedeletedlivevaccine)⑤蛋白工程疫苗(proteinengineeringvaccine)2.遺傳重組疫苗(geneticrecombinantvaccine)

3.合成肽疫苗(synthticpeptidevaccine)4.抗獨特型Ab疫苗(anti-idiotypeAbvaccine)5.微膠囊可控緩釋疫苗(controllablereleasedmicro-capsulevaccine)（一）基因工程疫苗geneengineeringvaccine基因工程疫苗，也稱遺傳工程疫苗（geneticengineeringvaccine），指使用重組DNA技術克隆并表達保護性抗原基因，利用表達的抗原產物，或重組體本身制成的疫苗。主要包括基因工程亞單位疫苗，基因工程載體疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五種。

1、基因工程亞單位疫苗(geneengineeringsubunitvaccine)基因工程亞單位疫苗，主要是指將基因工程表達的蛋白抗原純化后制成的疫苗。優(yōu)點：①產量高；②純度高；③安全性高；④用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。缺點：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，免疫效果較差。增強其免疫原性的方法：①調整基因組合使之表達成顆粒性結構②是在體外加以聚團化，包入脂質體或膠囊微球③加入有免疫增強作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。

2、基因工程載體疫苗（geneengineeringvectorvaccine）基因工程載體疫苗是指利用微生物做載體，將保護性抗原基因重組到微生物體中，使用能表達保護性抗原基因的重組微生物制成的疫苗。優(yōu)點：疫苗多為活疫苗，重組體用量少，抗原不需純化，載體本身可發(fā)揮佐劑效應增強免疫效果缺點：曾感染過腺病毒或者接種過痘苗的人，對載體微生物已具有免疫力，使之接種后不易繁殖，因而影響免疫效果。

3、核酸疫苗（nucleicacidvaccine）核酸疫苗或稱基因疫苗（genevaccine），指使用能夠表達抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。優(yōu)點：①易于制備；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多聯(lián)多價疫苗。缺點：①外源核酸是否會整合到染色體中引起癌變；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗體的產生，免疫耐受等。4、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）基因缺失活疫苗使用分子生物學技術去除與毒力有關的基因獲得的缺失突變毒株制成的疫苗。優(yōu)點：①有突變性狀明確、穩(wěn)定；②不易返祖、毒力恢復；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途徑。5、蛋白工程疫苗（proteinengineeringvaccine）蛋白工程疫苗是指將抗原基因加以改造，使之發(fā)生點突變、插入、缺失、構型改變，甚至進行不同基因或部分結構域的人工組合，以期達到增強其產物的免疫原性，擴大反應譜，去除有害作用或副反應的一類疫苗。（二）遺傳重組疫苗（geneticrecombinantvaccine）遺傳重組疫苗是指使用經遺傳重組方法（geneticrecombination）獲得的重組微生物制成的疫苗。通常是將對人體無致病性的弱毒株與強毒株（野毒株）混合感染，弱毒株與野毒株間發(fā)生基因組片段交換造成重組，然后使用特異方法篩選出對人體不致病的但又含有野毒株強免疫原性基因片段的重組毒株。（三）合成肽疫苗（Syntheticpeptidevaccine）合成肽疫苗是指使用化學方法合成能夠誘發(fā)機體產生免疫保護的多肽制成的疫苗。優(yōu)點：①純度和安全性高；②副作用小；③可長期在常溫下保存；缺點：①其抗原性單一；②免疫原性弱。因此須用幾種合成肽抗原聯(lián)合使用，還須用多種方法提高合成肽的免疫原性。（四）抗獨特型抗體疫苗（anti-idiotypevaccine）抗獨特型抗體疫苗是指使用與特定抗原的免疫原性相近的抗體（ab2）做抗原制成的疫苗。目前此疫苗尚處于理論性研究階段。（五）微膠囊可控緩釋疫苗(controllablereleasedmicro-capsulevaccine)微膠囊可控緩釋疫苗，指使用微膠囊技術將特定抗原包裹后制成的疫苗。特點①小于10μm的微膠囊在注射部位可被巨噬細胞吞噬并攜帶至淋巴結附近和免疫系統(tǒng)其他部位，具有更強的免疫效果。②大于30μm的微膠囊，更適于做可控緩釋。由于微膠囊的保護作用，母體抗體不能使抗原失活，可用于嬰幼兒免疫接種。③微膠囊在腸道內不受酸或酶的影響，可用于口服。

第三節(jié)基因工程病毒疫苗的開發(fā)現(xiàn)狀一、急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十幾種疾病-預防性疫苗治療性疫苗艾滋病+（需要）+乙型肝炎++丙型肝炎++戊型肝炎+-（不需要）EBV肝炎++表4-2需要研制的基因工程病毒疫苗人乳頭瘤病毒感染（宮頸癌）++單純皰疹病毒感染（Ⅰ、Ⅱ型）++巨細胞病毒感染++呼吸道和細胞病毒感染+-輪狀病毒感染+-登革熱病毒感染+-埃博拉病毒感染+-注：“+”表示需要，“-”表示不需要

二、值得使用基因工程技術進行改造的傳統(tǒng)病毒疫苗對那些免疫保護效果差，或副反應較大，或成本較高，或使用不方便的傳統(tǒng)疫苗，使用基因工程技術對其改造，或用基因工程疫苗取而代之，將具有極大的市場前景。傳統(tǒng)疫苗可能使用的基因工程疫苗類型流感基因缺失活疫苗，遺傳重組活疫苗甲型肝炎重組活疫苗，亞單位疫苗（病毒樣顆粒）乙型腦炎基因缺失活疫苗水痘重組活疫苗，基因缺失活疫苗麻疹重組活疫苗，基因工程亞單位疫苗黃熱重組活疫苗狂犬（人和獸）重組活疫苗，亞單位疫苗（病毒樣顆粒）出血熱基因缺失活疫苗腺病毒遺傳重配活疫苗，重組活疫苗輪狀病毒亞單位疫苗（病毒樣顆粒）聯(lián)合疫苗重組多價活疫苗，亞單位聯(lián)合疫苗表5-3值得使用基因工程技術進行改造的傳統(tǒng)病毒疫苗

三、重要病毒性疾病基因工程疫苗研究進展目前，病毒基因工程疫苗主要集中在研制常規(guī)技術不能或很難解決的新疫苗和改造免疫保護效果差，負反應較大，或成本較高，或使用不方便的傳統(tǒng)疫苗上，有的疫苗兼有預防和治療兩種功能現(xiàn)將我國重要的病毒病基因工程疫苗研究狀況概述如下（參見表5-4）。疫苗及靶抗原疫苗類型研究開發(fā)現(xiàn)狀國內國外1艾滋病毒苗—env.gag.pol.nef.v3亞單位多肽（細胞）亞單位多肽（酵母）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（痘苗）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（細胞）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（ALVAC）研究研究研究研究研究研究研究——Ⅱ期Ⅱ期Ⅱ期Ⅰ期研究研究Ⅰ期Ⅰ期表5-4我國重要病毒病基因工程疫苗研究開發(fā)狀況完整病毒顆粒減毒活疫苗（SIV）滅活疫苗（SIV）減毒活疫苗（HIV）減毒活疫苗（HLIV）DNA疫苗————研究——研究Ⅰ期Ⅰ期（動物）研究研究Ⅰ期聯(lián)合免疫多肽+痘病毒DNA+痘病毒研究研究Ⅰ期研究2乙肝疫苗—S亞單位顆粒（酵母）亞單位顆粒（CHO）亞單位顆粒（痘苗）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）亞單位顆粒（植物）DNA疫苗引進生產生產Ⅰ期研究研究研究生產研究研究研究Ⅰ期Ⅰ期研究—S2+S亞單位顆粒（CHO）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究生產研究研究—S1+S2+S亞單位顆粒（CHO）亞單位顆粒（酵母）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究I期Ⅲ期研究研究—Epitop(S1,S2,S)載體活疫苗（沙門菌）研究I期—C亞單位顆粒（大腸）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究3丙肝疫苗——C+E1+E2亞單位多肽（CHO）DNA疫苗研究研究研究研究4戊肝疫苗——ORF2,3亞單位多肽（大腸）亞單位多肽（酵母）亞單位多肽（昆蟲）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究5呼吸道合胞病毒疫苗—F+G載體活疫苗（痘苗）載體活疫羈（Ad4）研究研究研究研究—F亞單位多肽（大腸）研究Ⅱ期6巨細胞病毒疫苗——完整病毒顆粒減毒活疫苗（Towne）基因缺失活疫苗————II期研究7單純皰疹病毒疫苗——完整病毒顆?；蛉笔Щ钜呙纭狪期——gD,gB載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究8登革熱病毒疫苗——Dengnel,2,3,4E,Prem-E,NS1,NS2減毒活疫苗分子減毒活疫苗亞單位多肽（痘苗）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（原核）亞單位顆粒（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究研究Ⅱ期研究研究研究研究研究研究研究研究9乳頭瘤病毒疫苗——L1、L2、E6、E7載體活疫苗（痘苗）亞單位顆粒（酵母）亞單位顆粒（昆蟲）亞單位顆粒（原核）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究II期研究研究——E6、E7載體活疫苗（痘苗）研究I期10EB病毒疫苗——gp350,LMP1,LM2,C—Epitop載體活疫苗（痘苗）業(yè)單位多肽（合成）亞單位多肽（CHO）亞單位多肽（昆蟲）免疫細胞苗（樹突）DNA疫苗I期研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究11甲肝疫苗——ORF載體活疫苗（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）I期研究研究研究——VP1，VP3亞單位多肽（大腸）載體活疫苗（polio）研究研究研究研究12麻疹疫苗—HA+F載體活疫苗（ALVAC）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗——I期研究I期研究研究—完整病毒基因缺失活疫苗研究研究13出血熱疫苗—G1，G2，NP載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）亞單位顆粒（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）研究研究研究研究I期——研究研究14小兒輪狀病毒疫苗—人/猴病毒重組減毒活疫苗（重配）——IV期—人/牛病毒重組減毒活疫苗（重配）——III期—人/羊病毒重組減毒活疫苗（重配）IV期———VP4，VP7，VP6亞單位顆粒（昆蟲）載體活疫苗（原核）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）研究——研究研究研究研究研究研究15狂犬病疫苗—外膜糖蛋白載體活疫苗（痘病毒）研究IV期（動物）載體活疫苗（Ad）研究研究多價疫苗—DTP+HBV，DTP+IVP，DTP+IVP+HBVDTP+HBV+HAV聯(lián)合疫苗（傳統(tǒng)技術+基因工程）研究II期16—甲肝、乙肝、麻疹、RSV載體活疫苗（痘苗）多價DNA疫苗研究研究研究研究1、艾滋?。ˋIDS）疫苗（1）研究的三階段：①最早使用其膜抗原gp120（Glucoseprotein120）②膜抗原加其他能誘發(fā)細胞免疫抗原的多抗原疫苗的復雜設計；③在泰國使用gp120亞單位疫苗數(shù)千人免疫接苗無效后，改為先用重組痘病毒ALVA（疫苗注射后），再使用gp120亞單位疫苗加強，80%以上的人產生了特異的體液和細胞免疫反應。（2）HIV感染特點：①HIV直接感染破壞免疫細胞；②HIV變異極快。（3）AIDS疫苗研究方向：①能誘發(fā)有效的中和抗體，阻止或大部阻止HIV感染免疫細胞；②能誘發(fā)強細胞免疫；③中和抗體屏障被部分突破時能有效清除被感染細胞，是研究中應統(tǒng)籌考慮的。2、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（1）目前存在的問題：人群中約10%左右對現(xiàn)有乙肝疫苗（僅含S抗原的疫苗）無反應；（2）研制方向：使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使對現(xiàn)有S乙肝疫苗無反應的人群產生良好的免疫反應。目前，含前S的疫苗，新佐劑乙肝疫苗，乙肝抗原抗體復合物疫苗，治療性乙肝研究的熱點。（3）丙型肝炎病毒（HCV）疫苗

丙型肝炎感染約占人群2%左右，也就是有2000多萬感染者，大部分都會轉為慢性，并導致肝硬化和肝癌，危害遠大于乙肝。研究方向；①多數(shù)實驗集中于使用病毒外膜蛋白E1+E2研制病毒樣顆粒的亞單位疫苗和②使用載體進行重組活疫苗研究。③由于丙肝病毒變異快，極易沖破已有中和抗體的屏障，④選擇變異不大且能誘發(fā)細胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。4、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗戊型肝炎病毒屬杯狀病毒科，單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.4kb。經消化道傳播，暴發(fā)流行和散發(fā)兩種，戊型肝炎的臨床表現(xiàn)比甲型肝炎重。選擇基因工程的手段研制戊型肝炎疫苗唯一的方法。基因工程疫苗主要采用原核細胞、酵母細胞和昆蟲細胞三種表達體系。

我國目前以原核細胞和酵母細胞對戊型肝炎病毒結構蛋白均表達成功（張明程，1999）抗原性在世界范圍內穩(wěn)定，表明戊型肝炎病毒基因工程疫苗將對該病的預防具有良好的效果。

5、呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗

呼吸道合胞病毒屬單股副鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒肺炎的主要病因。RSV保護性抗原主要是其糖蛋白F和G，高度糖化蛋白，抗原結構復雜，屬結構依賴性抗原，產生中和抗體的能力都很差，給研制RSV蛋白亞單位疫苗帶來了一定困難。

研制方向：目前研制的高度減毒的非復制型載體是研制該疫苗的重要途徑；制備減毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一個重要途徑，負鏈RNA病毒cDNA轉染技術的成功給使用現(xiàn)代分子生物學技術制備RSV的分子減毒活疫苗帶來了希望，也是目前RSV疫苗研制重要途徑。6、人巨細胞病毒（HMV）疫苗（1）危害：HMV屬皰疹病毒科，通常為隱性感染，無明顯臨床癥狀。然而HMV的潛伏感染將對人體健康造成極大威脅。（2）問題：該疫苗株雖能誘發(fā)體液和細胞免疫，但保護作用不強，且其潛在的致癌性，以及尚未能最終排除的潛伏感染性，使該類活疫苗尚未能廣泛使用。（3）研制方向：

目前使用分子生物學技術，有目的地去除與與毒力、潛伏及腫瘤相關基因的分子減毒疫苗株正在研制中?；蚬こ碳夹g表達的gB做亞單位疫苗或重組活疫苗的研究已成為目前HMV疫苗研究的一個重要方向。7、單純皰疹病毒（HSV）疫苗（1）危害：單純皰疹病毒有兩種類型（HSVI和HSVII），在人群中感染相當廣泛。HSVI人群感染率高到50%-90%，多為隱性潛伏性感染。母嬰傳播中皰疹性角膜炎視力障礙新生兒死亡率高達60%。在病毒性腦炎中，HSVI型感染引起的占10%。HSVII主要經過性傳播，病毒檢出率可達5%-12%。HSVII感染是宮頸癌的重要誘因之一。（2）方向：

病毒糖蛋白gD和gB是主要的保護性抗原，與gC、gE、gI聯(lián)合使用可誘生體液和細胞免疫，在動物實驗中，HSVIIgD的核酸疫苗可以保護動物免受感染及隨后的潛伏感染，這些研究為單純皰疹病毒疫苗的研究提供了有力的證據(jù)。8、登革熱病毒疫苗（Denguefevervirusvaccine）（1）危害：登革熱病毒屬黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，有4個血清型，蚊子叮咬傳播給人，在我國南方熱帶亞熱帶地區(qū)發(fā)生過多次登革熱流行。（2）方向：

①通過表達prM-E形成病毒樣顆粒的亞單位疫苗顯示了較好安全性和免疫保護性，是該疫苗研究的重要方向。②使用該病毒感染性cDNA進行的分子減毒活疫及多種亞型嵌合的減毒活疫苗研究也取得了較好效果，是另一個重要途徑。

9、人乳頭瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）疫苗人乳頭瘤病毒是環(huán)型雙鏈dsDNA病毒，其中與宮頸癌密切相關的有HPV16、18、33、58等亞型。外殼蛋白L1和L2能誘發(fā)機體產生體液和細胞免疫，預防乳頭瘤病毒感染；E6和E7是與細胞轉化有關的蛋白，表達E6和E7的重組痘病毒疫苗能有效阻止HPV陽性的宮頸癌細胞生長和轉移。表達HPV16和HPV18兩型E6和E7的重組痘苗病毒已進行了小量人體觀察，證明產生了部分抑制腫瘤生長的結果（1996）。L1和L2可在細菌、酵母及痘苗病毒載體中很好表達，并形成病毒樣顆粒，有很好的安全性和免疫效果。治療性疫苗以E6和E7為主，加上L1和L2可增強治療性疫苗免疫效果。10、Epstein-Barr病毒（EB）疫苗（1）危害：EB病毒為皰疹病毒科，嗜淋巴細胞病毒屬，感染廣泛，90%以上成人都感染過此病毒。（2）方向：①阻斷其原發(fā)感染；②清除鼻咽癌細胞。

（3）方法：前者主要以EBV的MA（如gp350）為免疫原，gp350亞單位疫苗和表達gp350的重組痘苗病毒活疫苗顯示了一定抗瘤作用；后者主要以EBV的潛伏膜蛋白LMP1和LMP2為免疫原，進行了多肽、重組活疫苗、DNA疫苗免疫細胞疫苗等多種嘗試。11、埃博拉病毒（EBV）疫苗vaccine）

埃博拉病毒是單股負鏈RNA病毒，屬絲狀病毒，致死率極高。致病機制尚不清楚，曾試用過滅活疫苗，效果不好，減毒疫苗存在危險性，至今尚未成功。

第四節(jié)疫苗生產工藝流程

菌（毒）種培養(yǎng)物（培養(yǎng)基、動物、禽胚或細胞等）收獲抗原（培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細胞液等）配苗

分裝凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。病毒性細胞疫苗的制造工藝流程健康動物（或胚胎）組織原料細胞懸液生長細胞病毒液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗基礎種毒生產用種毒原料保護劑配制滅菌細胞培養(yǎng)液傳代細胞滅活病毒液配苗（混勻、乳化）分扎蓋帖簽裝滅活疫苗檢驗原料佐劑配制滅菌滅活檢驗配制培養(yǎng)收獲病毒性組織疫苗的制造工藝流程感染動物或胚胎分裝、扎蓋、貼簽健康動物或SPF雞胚等健康動物或SPF雞胚等動物或SPF雞胚等基礎種毒生產用種毒收獲感染組織或胚液純化配制成含毒懸液配苗分裝凍干活疫苗保護劑原料配制檢驗滅活病毒液配苗、乳化滅活疫苗原料佐劑配制滅活檢驗十萬級潔凈走道以馬立克CVI988/Rispens為例，簡述細胞苗生產工藝細胞制作1、選擇孵育10天、發(fā)育良好的SPF雞胚；2、胚體去頭及內臟；3、加入胰蛋白酶，采取磁力攪拌的方法將雞胚組織消化成單個的細胞；4、冷凍離心后，取細胞；5、將細胞加入培養(yǎng)液(進口試劑)，制成細胞懸液(加入進口血清)；6、將細胞懸液加入轉瓶，置37℃培養(yǎng)；工藝介紹工藝介紹工藝介紹工藝介紹工藝介紹工藝介紹接毒1、細胞經37℃培養(yǎng)24小時，即可長成細胞單層；2、將種毒接入細胞單層（必要時需吸附30分鐘左右）；3、加入培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)。工藝介紹工藝介紹工藝介紹收獲1、含毒細胞經培養(yǎng)60-72小時，病變達80%以上時即可收獲；2、將轉瓶中培養(yǎng)液棄去；3、加入胰酶-EDTA消化液（使細胞間結構疏松），將細胞單層消化成單個細胞；4、加入停消液終止消化；5、冷凍離心后取細胞，用凍存液懸浮。工藝介紹工藝介紹工藝介紹工藝介紹分裝、凍存1、使用進口分裝機，將含毒細胞的凍存液準確地分入安瓿瓶（懸液瓶置于磁力攪拌器上，確保均勻），裝夾；2、將安瓿瓶放入液氮程序降溫儀，采取特殊工藝使其降溫至-70℃；3、將安瓿（夾）移入液氮（-196℃）保存。工藝介紹德國引進R921全自動安瓿灌封機從美國CBS公司引進程序降溫儀液氮苗存放間全景以新城疫活疫苗（ZM10）為例簡述組織苗生產工藝10萬級凈化條件下的雞胚前孵化廠房(3)1、種毒選擇必須選擇SPF蛋制作種毒；種毒分為原始種毒、基礎種毒、種毒批；胚體符合新城疫典型特征：頭、肢、腹有出血點；心臟腫大，心尖有出點；胚液HA達512以上；效價達108.5EID50/0.1ml；無細菌、霉菌、支原體和外源病毒。2、選擇雞胚必須選擇SPF蛋；產蛋日齡最好控制在２６周～５６周內；盡量采購３天以內的新鮮種蛋，最遲不超過七天；種蛋產出后４小時內進行熏蒸消毒，種蛋在１４～１８℃，相對濕度６５％左右最適；單枚蛋重４８～６０g之間，雞蛋大小均勻一致；蛋殼質量：應選擇表面致密，鈣質分布均勻的種蛋，剔除沙殼，畸形，破殼及表面不清潔的種蛋．操作時要輕拿輕放；入孵前進行熏蒸消毒；孵化溫度３７．５～３８．５℃，相對濕度５５～７０％；翻蛋次數(shù)一次／２小時；孵化至５～７日齡須照蛋，剔除不受精和死胚；孵化至10日齡備用。3、接種種毒將種毒作數(shù)萬倍稀釋；通過自動接種機，將種毒由雞胚氣室部位接入到尿囊腔內；用膠液將接種孔封閉；后孵化：溫度36.5-37℃，相對濕度在60%左右；后孵化不翻蛋。4、收獲將后孵至72-96小時的雞胚置4℃冷卻6小時；檢查胚體是否符合新城疫典型特征：頭、肢、腹有出血點；心臟腫大，心尖有出點；胚液HA達512以上；通過自動收獲機收獲雞胚的尿囊液；收獲的尿液經病毒濃縮設備進行4-10倍濃縮（產品的均一與穩(wěn)定）；濃縮抗原再經除菌設備進行除菌。美國引進MILLIPORE病毒濃縮器5、中間檢測效價檢測：抗原效價必須達08.5EID50/0.1ml×濃縮倍數(shù)。無細菌、霉菌、支原體和外源病毒。6、配苗、分裝、凍干、軋蓋、貼標根據(jù)濃縮倍數(shù)、檢測的效價和設計羽份確定配苗比例，以期產品的均一與穩(wěn)定；用自動分裝機進行定量分裝（半加塞）；進入凍干機進行程序凍干（自由水和結合水）；凍干結束后，進行軋蓋、貼標（先確定羽份）、包裝（即時包裝）。德國STERIS公司引進LYOVAC凍干機(1)德國引進BOSCH全自動疫苗分裝線(1)德國引進BOSCH全自動疫苗分裝線(2)德國引進BOSCH全自動疫苗分裝線(3)7、成品檢驗物理性狀檢測剩余水分測定無菌檢驗支原體檢驗鑒別檢驗安全檢驗效力檢驗真空度檢測耐老化檢驗外源病毒檢驗

第五節(jié)我國基因工程病毒疫苗的開發(fā)戰(zhàn)略研究（Developmentstrategyofgeneengineeringvaccineinchina)一、首先要明確基因工程病毒疫苗在整個病毒疫苗研究開發(fā)中的地位和任務(Statusandtask)1主要常規(guī)技術不能或很難解決的新疫苗(Newgenerationvaccine)

①不能或難于培養(yǎng)的病原體；②有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體。2、傳統(tǒng)疫苗的改造（(Reconstructionoftraditionalvaccine）主要針對免疫效果差，負反應大，成本較高和使用不方便的傳統(tǒng)疫苗進行改造。3、加強治療性疫苗研究

（Intensificationofcurevaccineresearch)近年來，使用疫苗進行疾病治療的研究發(fā)展迅速，對引起慢性或持續(xù)性感染或與誘發(fā)腫瘤十分相關的病毒病，治療性疫苗的研究將具有重要性。4、發(fā)展多價疫苗

多價疫苗成本低，免疫程序簡單，是疫苗研究的發(fā)展方向。其發(fā)展方向為：

①使用基因工程技術對傳統(tǒng)疫苗進行改造，獲得聯(lián)合疫苗；②發(fā)展具有高導入、高表達、強免疫、可加強的新型載體。二、目標的選擇要以社會和市場需求為導向

1、研制預防我國嚴重病毒病的疫苗放在重點位置2、大力發(fā)展有市場前景新型疫苗

三、加強新型疫苗的基礎研究

1、加強疾病免疫保護機制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanism）(1)選取病原體的某些抗原或某些抗原表位，或刪除某些無用甚至有害的組分而構成的，因而必須了解這些抗原、表位或組分在病原體致病和免疫中的作用和機體對它們的應答。(2)一些發(fā)病和免疫機制比較簡單的疾病已用常規(guī)疫苗解決了，留下的是一些比較復雜和較難解決的疾病或問題，例如呼吸道、腸道和生殖系統(tǒng)黏膜感染，其病原體常多型善變；易于產生持續(xù)感染基因整合的病毒；免疫病理機制不清的病毒；病原體結構復雜，發(fā)育階段多，免疫保護作用不強；常規(guī)疫苗由于反應大，效果差或引起個別嚴重并發(fā)癥，需用新型疫苗來代替。

2、加強新型疫苗的免疫保護機制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanismofnovelvaccine）新型疫苗抗原的免疫保護效果是新型疫苗研究的首要問題。活疫苗（包括基因工程活疫苗）最近似地模擬了感染后免疫，因而基因工程多肽疫苗和合成寡肽往往是用單一或少數(shù)幾種保護性抗原，甚至單一個主要抗原表位代替完整的菌體或病毒顆粒。產生的兩個問題：

第一，分子越小，其免疫原性越弱。因此多肽疫苗常需要用強有力的佐劑，以增強其免疫原性，合成寡肽則除了強佐劑以外，還要求偶聯(lián)于一種載體蛋白上。

第二，產生的免疫僅針對一種抗原，甚至一個抗原表位，在免疫的綜合性方面就與感染后免疫相差甚遠，其有效保護程度和時間還需通過實踐加以檢驗。

基因工程疫苗類型和表達系統(tǒng)的選擇對獲得有效的免疫保護常用關鍵性意義。新型疫苗的作用方式對機體的免疫系統(tǒng)產生重要影響。任何疫苗的作用機體的方式都不會與病原自然作用方式完全相同，因此必然產生新的免疫特點。在載體疫苗，特別是核酸疫苗中，這個問題尤為明顯。在甲型流感的自然感染中，不同亞型間的共同抗原核蛋白無中和活性，也不能產生亞型間交叉保護。3、提高新型疫苗免疫效果(Enhancetheimmuneeffectofnewvaccine)基因工程多肽或寡肽疫苗成敗的關鍵是如何克服免疫原性弱、免疫綜合性差的問題。（1）多抗原表達（Multi-antigenexpression)新型疫苗的一個趨向是應用二個以上抗原。第一類都是表面抗原（2種以上）；第二類是同時用表面與內部抗原誘生中和抗體；第三類是用表面抗原與非結構蛋白。（2）顆粒性抗原(Granularantigen)①在體外將多肽聚團化可形成100nm左右顆粒，如加入皂角糖苷（QuilA）可形成“免疫刺激復合物”（Immunostimulatingcomplex，ISCOM）；②將抗原包入脂質體內可形成免疫脂質體。

③應用基因工程或化學交聯(lián)方法將B細胞表位結合到HbsAg,核心Ag或輪狀病毒核心表面，以增強免疫原性，特別是HbcAg具有T細胞依賴性和非依賴性免疫作用，是較為理想的顆粒型載體。④有些病原結構基因的表達可產生不含核酸的病毒樣顆粒，人類細小病毒B19株的殼蛋白可形成空心外殼；在痘苗中同時表達HIV的gag和env基因可形成類似病毒的顆粒。（3）蛋白質工程抗原

①多個寡肽串聯(lián)成“雞尾酒式疫苗”是首先針對惡性瘧原蟲而提出的，是將多個不同的B細胞表位和多個TH細胞表位串聯(lián)起來，同時刪除可能存在的抑制性T細胞（suppressorTcell，Ts）表位。②另一個也屬于蛋白質工程范疇，是將本來在細胞內表達的抗原加以改造，使之表達于細胞膜表面，以增強其免疫原性。此外，將RSV的兩個表面抗原G和F組合成一個蛋白質的研究也相當深入，組合似不影響到它們各自的抗原特異性。（4）載體疫苗系統(tǒng)(Vectorvaccinesystem)

①基于病毒的載體活疫苗；②基于質粒DNA的非病毒載體疫苗。前者方向是“非復制型”載體，需克服不安全性和不易加強使用的缺點；后者方向是改進導入效率、提高抗原表達、增強免疫反應強度、克服潛在的致癌及免疫病理作用。其優(yōu)點是：廉價、高效、易于組合成多價疫苗，是新型疫苗的重要組成部分。其缺點是：①盡管用于載體研究的這些微生物都是疫苗株，但做為活疫苗載體，可能產生接種副反應。②機體內針對載體的抗體，不論是免疫前存在的，或是免疫后產生的，都會對相應載體疫苗的再次使用產生一定影響，從而影響其免疫效果。（5）免疫佐劑與聯(lián)合免疫

①強有力大都胞壁二肽的衍化物，如Syntex佐劑對多肽和寡肽都有很強的佐劑作用，能誘生抗體和細胞介導免疫，甚至超過了福氏完全佐劑，且無熱源性，不引起肉芽腫、關節(jié)炎或其他組織損害。在用HCG-的37肽作為避孕疫苗進行人體實驗時使用了這類佐劑。②淋巴因子如胸腺肽、白細胞介素-2、γ-干擾素等均曾用于免疫增強目的。IL-2似乎只對某些抗原有佐劑作用，且須每天注射。

③緩慢釋放抗原的微膠囊（microsphere），雖不是佐劑，卻能增強免疫效果。例如丙交酯與乙交酯共聚物，顆?？蛇_至3mm，小至1μm。④Al（OH）3依然獨占鰲頭。佐劑不但是亞單位疫苗成功的關鍵，而且還可通過選擇不同的佐劑改變疫苗免疫反應類型，增加疫苗用途，提高新的免疫接種途徑。

不同類型疫苗聯(lián)合應用，以達互補效果，是近年一些難度較大疫苗研制的新途徑。

第三節(jié)分析文體特征和表現(xiàn)手法2大考點書法大家啟功自傳賞析中學生，副教授。博不精，專不透。名雖揚，實不夠。高不成，低不就。癱偏‘左’，派曾‘右’。面微圓，皮欠厚。妻已亡，并無后。喪猶新，病照舊。六十六，非不壽。八寶山，漸相湊。計平生，謚曰陋。身與名，一起臭。【賞析】寓幽默于“三字經”，名利淡薄，人生灑脫，真乃大師心態(tài)。1.實用類文本都有其鮮明的文體特征，傳記的文體特征體現(xiàn)為作品的真實性和生動性。傳記的表現(xiàn)手法主要有以下幾個方面：人物表現(xiàn)的手法、結構技巧、語言藝術和修辭手法。2.在實際考查中，對傳記中段落作用、細節(jié)描寫、人物陪襯以及環(huán)境描寫設題較多，對于材料的選擇與組織也常有涉及。3.考生復習時要善于借鑒小說和散文的知識和經驗，同時抓住傳記的主旨、構思以及語言特征來解答問題。傳記的文體特點是真實性和文學性。其中，真實性是傳記的第一特征，寫作時不允許任意虛構。但傳記不同于一般的枯燥的歷史記錄，它具有文學性，它通過作者的選擇、剪輯、組接，傾注了愛憎的情感；它需要用藝術的手法加以表現(xiàn)，以達到傳神的目的?？键c一分析文體特征從哪些方面分析傳記的文體特征？一、選材方面1.人物的時代性和代表性。傳記里的人物都是某時代某領域較

突出的人物。2.選材的真實性和典型性。傳記的材料比較翔實，作者從傳主

的繁雜經歷中選取典型的事例，來表現(xiàn)傳主的人格特點，有

較強的說服力。3.傳記的材料可以是重大事件，也可以是日常生活小事。[知能構建]二、組材方面1.從時序角度思考。通過抓時間詞語，可以迅速理清文章脈絡，

把握人物的生活經歷及思想演變過程。2.從詳略方面思考。組材是與主題密切相關的。對中心有用的，

與主題特別密切的材料，是主要內容，則需濃墨重彩地渲染，

要詳細寫；與主題關系不很密切的材料，是次要內容，則輕

描淡寫，甚至一筆帶過。三、句段作用和標題效果類別作用或效果開頭段內容：開篇點題，渲染氣氛，奠定基調，表明情感。結構：總領下文，統(tǒng)攝全篇；與下文某處文字呼應，為下文做鋪墊或埋下伏筆；與結尾呼應。中間段內容：如果比較短，它的作用一般是總結上文，照應下文；如果比較長，它的作用一般是擴展思路，豐富內涵，具體展示，深化主題。結構：過渡，承上啟下，為下文埋下伏筆、鋪墊蓄勢。結尾段內容：點明中心，深化主題，畫龍點睛，升華感情、卒章顯志，啟發(fā)思考。結構：照應開頭；呼應前文；使結構首尾圓合。標題①突出了敘述評議的對象。②設置懸念，激發(fā)讀者的閱讀興趣。③表現(xiàn)了傳主的精神或品質。④點明了主旨，表達了作者的情感。⑤運用修辭，使文章內涵豐富，意蘊深刻，增加了文章的厚度與深度。四、語言特色角度分析鑒賞傳記的類別自傳采用第一人稱，語言或幽默調侃或自然親切；他傳采用第三人稱，語言或樸實自然或文采斐然。語意和句式句子中的關鍵詞所包含的情感、態(tài)度等，整句與散句、推測與肯定、議論與抒情、祈使與反問等特殊句式，往往有著不同一般的表現(xiàn)力。這些都是分析語言的切入點。修辭的角度修辭一般是用來加強語言的表現(xiàn)力的。抓住修辭特點，就能從語言的表達效果上加以體味。語言風格含蓄與明快、文雅與通俗、生動與樸實、富麗與素淡、簡潔與繁復等。1.(2015·新課標全國卷Ⅰ)閱讀下面的文字，完成后面的題目。[即學即練]朱東潤自傳1896年我出生在江蘇泰興一個失業(yè)店員的家庭，早年生活艱苦，所受的教育也存在著一定的波折。21歲我到梧州擔任廣西第二中學的外語教師，23歲調任南通師范學校教師。1929年4月間，我到武漢大學擔任外語講師，從此我就成為大學教師。那時武漢大學的文學院長是聞一多教授，他看到中文系的教師實在太復雜，總想來一些變動。用近年的說法，這叫作摻沙子。我的命運是作為沙子而到中文系開課的。大約是1939年吧，一所內遷的大學的中文系在學年開始，出現(xiàn)了傳記研究這一個課，其下注明本年開韓柳文。傳記文學也好，韓柳文學也不妨，但是怎么會在傳記研究這個總題下面開韓柳文呢？在當時的大學里，出現(xiàn)的怪事不少，可是這一項多少和我的興趣有關，這就決定了我對于傳記文學獻身的意圖?！端膸烊珪偰俊酚袀饔涱?，指出《晏子春秋》為傳之祖，《孔子三朝記》為記之祖，這是三百年前的看法，現(xiàn)在用不上了。有人說《史記》《漢書》為傳記之祖，這個也用不上。《史》《漢》有互見法，對于一個人的評價，常常需要通讀全書多卷，才能得其大略。可是在傳記文學里，一個傳主只有一本書，必須在這本書里把對他的評價全部交代。是不是古人所作的傳、行狀、神道碑這一類的作品對于近代傳記文學的寫作有什么幫助呢？也不盡然。古代文人的這類作品，主要是對于死者的歌頌，對于近代傳記文學是沒有什么用處的。這些作品，畢竟不是傳記文學。除了史家和文人的作品以外，是不是還有值得提出的呢？有的，這便是所謂別傳。別傳的名稱，可能不是作者的自稱而是后人認為有別于正史，因此稱為“別傳”。有些簡單一些，也可稱為傳敘。這類作品寫得都很生動，沒有那些阿諛奉承之辭，而且是信筆直書，對于傳主的錯誤和缺陷，都是全部奉陳。是不是可以從國外吸收傳記文學的寫作方法呢？當然可以，而且有此必要。但是不能沒有一個抉擇。羅馬時代的勃路塔克是最好的了，但是他的時代和我們相去太遠，而且他的那部大作，所著重的是相互比較而很少對于傳主的刻畫，因此我們只能看到一個大略而看不到入情入理的細致的分析。英國的《約翰遜博士傳》是傳記文學中的不朽名作，英國人把它推重到極高的地位。這部書的細致是到了一個登峰造極的地位，但是的確也難免有些瑣碎。而且由于約翰遜并不處于當時的政治中心，其人也并不能代表英國的一般人物，所以這部作品不是我們必須模仿的范本。是不是我國已經翻譯過來的《維多利亞女王傳》可以作為范本呢？應當說是可以，由于作者著墨無多，處處顯得“頰上三毫”的風神?？墒侵袊娜讼鄠鞯淖龇?，正是走的一樣的道路，所以無論近代人怎么推崇這部作品，總還不免令人有“穿新鞋走老路”的戒心。國內外的作品讀過一些，也讀過法國評論家莫洛亞的傳記文學理論，是不是對于傳記文學就算有些認識呢？不算，在自己沒有動手創(chuàng)作之前，就不能算是認識。這時是1940年左右，中國正在艱苦抗戰(zhàn)，我只身獨處，住在四川樂山的郊區(qū)，每周得進城到學校上課，生活也很艱苦。家鄉(xiāng)已經陷落了，妻室兒女，一家八口，正在死亡線上掙扎。我決心把研讀的各種傳記作為范本，自己也寫出一本來。我寫誰呢？我考慮了好久，最后決定寫明代的張居正。第一，因為他能把一個充滿內憂外患的國家拯救出來，為垂亡的明王朝延長了七十年的壽命。第二，因為他不顧個人的安危和世人的唾罵，終于完成歷史賦予他的使命。他不是沒有缺點的，但是無論他有多大的缺點，他是唯一能夠拯救那個時代的人物。(有刪改)【相關鏈接】①自傳和傳人，本是性質類似的著述，除了因為作者立場的不同，因而有必要的區(qū)別以外，原來沒有很大的差異。但是在西洋文學里，常會發(fā)生分類的麻煩。我們則傳敘二字連用指明同類的文學。同時因為古代的用法，傳人曰傳，自敘曰敘，這種分別的觀念，是一種原有的觀念，所以傳敘文學，包括敘、傳在內，絲毫不感覺牽強。(朱東潤《關于傳敘文學的幾個名詞》)②朱先生確是有儒家風度的學者，一身正氣，因此他所選擇的傳主對象，差不多都是關心國計民生的有為之士。他強調關切現(xiàn)實，拯救危亡，尊崇氣節(jié)與品格。這都是可以理解的。(傅璇琮《理性的思索和情感的傾注——讀朱東潤先生史傳文學隨想》)★作為帶有學術性質的自傳，本文有什么特點？請簡要回答。答：________________________________________________解析本題考查分析文本的文體基本特征和語言特色。解答時，要在閱讀的基礎上，了解文章的文體特征、內容的側重點、內容表達的特征。本文作為一篇帶有學術性質的自傳，突出特點之一就是偏重學術經歷，介紹了自己的傳記文學觀及其形成過程。文章的開頭與結尾，將自己的生平與學術結合起來，尤其是為張居正寫傳原因的解說，結合當時的社會背景和自己家庭的情況，更是呈現(xiàn)出學術背后的家國情懷。在行文方面，語言平易自然，穿插“怎么會在傳記研究這個總題下面開韓柳文呢？”“我寫誰呢？”等口語，語言平白如話，就像面對面閑談一樣。答案①偏重學術經歷，主要寫自己的傳記文學觀及其形成過程；②寫生平與寫學術二者交融，呈現(xiàn)學術背后的家國情懷；③行文平易自然，穿插使用口語，就像和老朋友閑談一樣。1.一般和具體結合我們在對文本的一般性特征進行分析的同時，也應該注意到富有個性的“具體”的特征。[思維建模]分析文體特征2要領2.注意效果解讀

分析文體特征時，不能僅僅停留在辨別認知的層面上，而必須懂得去對它們做“效果”分析。對“效果”的分析不外乎從這樣的兩個方面去考慮：一是從表達者的表達這個方面去考慮，看他采用這樣的方式會給他的表達帶來怎樣的好處；二是從閱讀者這個方面考慮，看他這樣做可以對讀者的閱讀產生什么樣的積極的效果。分析傳記的文體特征?咀嚼經典高考題目提升審題答題技能高考曾經這樣考品答案，悟技巧，不丟分1.(2014·遼寧卷)本文第一自然段有何作用？請簡要分析。(6分)(《侯仁之：城市的知音》)①交代侯仁之選擇歷史專業(yè)的原因；②寫出了侯仁之對國家民族命運的關注，使傳主形象更加豐滿；③體現(xiàn)了傳記的真實性；④為下文介紹侯仁之的學術研究及成就做鋪墊。(答出1點給1分，2點給3分，3點給5分，4點給6分)2.(2013·福建卷)文章已有“《夢里京華》”一例，為何還要例舉“委曲求全”？請簡要分析。(4分)(《那一種遙遠的幽默》)①增強說服力，進一步突出王文顯劇作別有一番幽默，肯定他喜劇創(chuàng)作的能力和影響。②引出下文對王文顯任代理校長時行事風格的敘寫，形成對比，以突出王文顯治校的持重務實，一絲不茍。(每點2分，意思對即可。)3.(2012·新課標全國卷)12(1)選項E：本文擷取謝希德人生的若干片斷，描寫她熱愛祖國、獻身科學、關愛親人的事跡，表現(xiàn)了一位杰出女性的偉大人格。(√)(《謝希德的誠與真》)本選項考查對文體特征的理解，涉及文章的選材、文本的主要內容與主題等內容。(正確選項，3分)因傳記是記載人物生平或事跡的一類記敘文體，它的表達技巧比較接近于小說和散文，可以說文學類文本的表現(xiàn)手法都與傳記相通。由于傳記的文體特征，需要格外注意其他人物對傳主的映襯、細節(jié)描寫、引用和議論等方面。考點二分析表現(xiàn)手法3題型(一)敘述1.順敘的作用(效果)：思路清晰，結構條理。2.倒敘的作用(效果)[知能構建](1)能增強文章的生動性，使文章產生懸念，更能引人入勝。(2)強調作用，這一段主要寫了……放到開頭強調了傳主的……(與傳主精神、品質等的關系)。(3)表達了作者對傳主怎樣的情感(與作者情感的關系)。(4)深化了主旨(與主旨的關系)。(5)使文章結構富于變化，避免了敘述的平淡和結構的單調。3.插敘的作用(效果)(1)內容上：①(如果是引述他人的話，或是傳主自己的話、書信等)突出了傳記的真實性，使文章內容更充實。②深化了文章主題。③使人物形象更加鮮明。④(如果是引述他人的話等就屬于側面描寫)側面烘托了傳主的……⑤(如果插敘的語段拿傳主和其他人對比)通過對比，襯托出了傳主的……(2)結構上：①避免了結構的平鋪直敘，使行文起伏多變，使結構更加緊湊集中。②對……做了必要的鋪墊照應，補充說明。(二)描寫(主要是細節(jié)描寫)1.描寫的三種作用(1)讓傳主形象更全面完整，更立體化。傳主形象是由多個側面組成的，只表現(xiàn)其偉大的一面，而不展現(xiàn)其普通的一面，人物就不能立體化。

(2)讓人物真實可信。要把人物寫好，就要寫其普通的一面，因為讀者是普通的公民，他愿意接受偉人身上普通的一面。這樣的人物會讓讀者覺得真實親切，易于接受。(3)符合讀者心理需要。對于大人物諸如政治家、藝術家、影視明星等，讀者已經從媒體中了解了一些他們在本行業(yè)內的成就、事跡。對于傳記作品，讀者更渴望了解一些花絮。因此，一些細節(jié)正能解決這一問題。2.兩種答題方式(1)如果是寫人物的細節(jié)，可以這樣：①思維趨向：寫人物的細節(jié)＝細節(jié)內容＋獨特形象＋表現(xiàn)主題＋讀者心理。②答題方式：通過描寫…