熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)干貨教材課件

熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項(xiàng)目部內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程熒光定量PCR儀生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南2熒光定量PCR原理－－定義實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)3熒光定量PCR原理－－標(biāo)記方法4SYBRGreenI4TaqManProbe分子信標(biāo)SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI5SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理66SYBRGreenI染料法－－融解曲線7將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜7SYBRGreenI染料法－－融解曲線8融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光：定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光：定量不準(zhǔn)確8Taqman探針法－－原理95′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，MGB為不發(fā)光的熒光基團(tuán)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針，R與Q分開，發(fā)熒光。

9Taqman探針法－－工作機(jī)理10熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR10Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會(huì)淬滅熒光素引物盡量靠近探針,擴(kuò)增片段<400bp,引物Tm為59-60℃反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM其他與常規(guī)PCR相同1111實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)12標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑12實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)13FRET13幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較14方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷分子信標(biāo)高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析14熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值1515熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線16Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件16熒光定量PCR原理－－熒光閾值17Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置:大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過閾值Threshold17熒光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ctvalue18熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性19橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性19熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理20理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)20熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理21非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率21熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理22在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）22熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系23CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。23熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)24線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3－-3.5PCR擴(kuò)增效率（E）：0.9-1.2檢測(cè)靈敏度確認(rèn)35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增Notemplatecontrol確認(rèn)35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生24熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等絕對(duì)定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測(cè)等相對(duì)定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等2525熒光定量PCR的解析方法絕對(duì)定量解析方法相對(duì)定量解析方法2626絕對(duì)定量的定義27Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量27絕對(duì)定量分析幾要素28一個(gè)目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreenI法或Taqman探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線(探針法不需要)。28絕對(duì)定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用29質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法30倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v30絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－畢赤酵母A基因的絕對(duì)定量31方法：檢測(cè)畢赤酵母的A基因標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5個(gè)濃度；3個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟：提取ADNA；

設(shè)計(jì)特異引物；設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取畢赤酵母的A的精確copy數(shù)。31絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－畢赤酵母A基因的絕對(duì)定量32Samplecopies/mlCt1Ct3Ct2MeanCtSTD標(biāo)準(zhǔn)品1.41×10522.3322.2022.4622.330.13標(biāo)準(zhǔn)品1.41×10618.7018.3218.6118.540.20標(biāo)準(zhǔn)品1.41×10715.0915.1515.3715.200.19標(biāo)準(zhǔn)品1.41×10811.7811.9811.6211.790.18標(biāo)準(zhǔn)品1.41×1098.308.358.268.300.046未知樣品?18.4418.4718.4418.450.024空白對(duì)照NoneNone32絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－畢赤酵母A基因的絕對(duì)定量33擴(kuò)增效率（E）計(jì)算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。33絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－畢赤酵母A基因的絕對(duì)定量34未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22634相對(duì)定量的必要性35SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實(shí)際目的基因表達(dá)量分析35相對(duì)定量分析方法36比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點(diǎn)：基因的相對(duì)表達(dá)量，而不是基因的絕對(duì)量！36相對(duì)定量分析幾要素37一個(gè)參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本一個(gè)目的基因管家基因——用來校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）37相對(duì)定量分析－－管家基因篩選38管家基因維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O38相對(duì)定量分析－－兩種常用的分析方法39雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△Ct法39相對(duì)定量分析－－雙標(biāo)曲線法40通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。公式：相對(duì)值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測(cè)樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值40相對(duì)定量分析－－雙標(biāo)曲線法41優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一檢測(cè)樣品目的基因A管家基因H定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對(duì)量對(duì)照樣品123456780.2171.000待測(cè)樣品1112455780.2010.926待測(cè)樣品2108957890.1880.866實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)41相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法42假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：或最后用任一待測(cè)樣本q的XN

除以對(duì)照樣本（calibrator，cb）的XN

得到：

對(duì)于一個(gè)少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照因子而言就是：XT是目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)RT是內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)42相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－優(yōu)點(diǎn)：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一

待測(cè)組目的基因平均Ct值待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值對(duì)照組目的基因平均Ct值對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－43相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法44實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：2-△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%

△Ct（處理前）＝15－13＝2△Ct（處理后）＝18－20=－2

△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－2－2＝－4比率（處理后/處理前）＝2－△△Ct＝2－（－4）＝16所以Jun基因在處理后表達(dá)水平是處理前的16倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式可修正為1.95－△△CtSampleJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E處理前15131.95處理后18201.9544熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)45樣品制備定量體系配備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法45熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)46樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)46熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)47樣品制備試劑選擇定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化AMVM-MLV高效，全長的cDNA下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇47