第五章發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控課件

第五章發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控

.7/24/2023微生物發(fā)酵主要產(chǎn)品微生物菌體微生物酶微生物代謝產(chǎn)物厭氧發(fā)酵產(chǎn)物好氧發(fā)酵產(chǎn)物酒精丙酮丁醇氨基酸蛋白質(zhì)檸檬酸核苷酸抗生素微生物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵機(jī)制：微生物通過(guò)其代謝活動(dòng)，利用基質(zhì)（底物）合成人們所需要的代謝產(chǎn)物的內(nèi)在規(guī)律。.7/24/2023微生物的代謝產(chǎn)物很多，主要有乙醇、丙酮、乳酸、氨基酸、酶制劑、抗生素等，在這些產(chǎn)物中，乙醇、丙酮、乳酸等，微生物可以在特定的外部環(huán)境下生成，這類(lèi)發(fā)酵稱為自然發(fā)酵。有些產(chǎn)物諸如氨基酸、酶制劑等，正常的微生物不能在培養(yǎng)基中大量合成與積累，需要通過(guò)化學(xué)的、物理的、生物的方法人為地改變其原來(lái)的代謝途徑，使之能夠分泌并積累特定的產(chǎn)物，這類(lèi)發(fā)酵稱為代謝控制發(fā)酵。

.7/24/2023發(fā)酵的類(lèi)型

根據(jù)微生物的種類(lèi)不同，可分為好氧性發(fā)酵、厭氧性發(fā)酵和兼性發(fā)酵。（1）好氧性發(fā)酵(aerobicfermentation)：在發(fā)酵過(guò)程中需要通入一定量的無(wú)菌空氣，滿足微生物呼吸需要。e.g.Bacillussubtilis-----------amylaseCorynebacterium265-----------inosinicacidAsp.nigerUv06---------citricacid

C.glutamicumAs1299---------glutamicacid.7/24/2023（2）厭氧性發(fā)酵(anaerobicfermentation)：在發(fā)酵過(guò)程中不需要供給無(wú)菌空氣。e.g.lacticacidbacteria--------lacticacid

Bacillusclostridium-------acetone-butanol（3）兼性發(fā)酵(facultativefermentation)：在有氧、無(wú)氧條件下均能生活。如酒精酵母，在缺氧條件下進(jìn)行厭氣性發(fā)酵積累酒精，而在有氧條件下則進(jìn)行好氧發(fā)酵，大量繁殖菌體細(xì)胞。.7/24/2023

在無(wú)氧條件下：

在乳酸菌中受乳酸脫氫酶的作用，丙酮酸作為受氫體而被還原為乳酸，即同型乳酸發(fā)酵；

在酵母菌中，丙酮酸受丙酮酸脫羧酶的作用生成乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶的作用下作為受氫體被還原為乙醇，即酒精發(fā)酵；

在梭狀芽孢桿菌中，丙酮酸脫羧生成乙酰COA，然后經(jīng)一系列變化生成丁酰COA、丁醛，兩者作為受氫體被還原生成丁醇，生成物中還有丙酮、乙醇，所以稱為丙酮-丁醇發(fā)酵。.7/24/2023在好氧發(fā)酵條件：丙酮酸進(jìn)入TCA環(huán)，進(jìn)行代謝，產(chǎn)生各種好氧代謝產(chǎn)物或完全氧化獲得能量。.7/24/20231，3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸第二階段己糖激酶磷酸葡萄糖異構(gòu)酶磷酸果糖激酶醛縮酶磷酸丙糖異構(gòu)酶磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油酸激酶磷酸甘油酸變位酶烯醇化酶丙酮酸激酶第一階段葡萄糖6-磷酸-葡萄糖6-磷酸-果糖1，6-二磷酸-果糖磷酸二羥丙酮3-磷酸-甘油醛.7/24/2023糖酵解途徑的特點(diǎn)糖酵解途徑廣泛存在于多種細(xì)胞中，它的任何一個(gè)反應(yīng)均不需要氧。糖酵解(EMP)途徑的每一步都是由酶催化的，其關(guān)鍵酶有己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。當(dāng)以其他糖類(lèi)作為碳源和能源時(shí)，先通過(guò)少數(shù)幾步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為糖酵解途徑的中間產(chǎn)物，這與從葡萄糖合成細(xì)胞機(jī)體的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)序列同樣有效。.7/24/2023糖酵解途徑的生理功能①供應(yīng)ATP形式的能量和NADH2形式的還原力；②是連接其他幾個(gè)重要代謝途徑的橋梁，包括三羧酸(TCA)循環(huán)、HMP途徑和ED途徑等；③產(chǎn)生的多種中間產(chǎn)物為合成反應(yīng)提供原材料；④通過(guò)逆向反應(yīng)可進(jìn)行多糖合成。

.7/24/2023糖酵解調(diào)節(jié)機(jī)制

EMP途徑中，有三個(gè)主要調(diào)節(jié)點(diǎn)，即三個(gè)激酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。即EMP途徑中的關(guān)鍵酶，EMP中三個(gè)不可逆步驟，只參與糖酵解，不參與糖新生。.7/24/20231，3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸第二階段己糖激酶磷酸果糖激酶丙酮酸激酶ATPATPAMP、ADP↑ATPADPATPADP丙酮酸激酶激活劑第一階段葡萄糖6-磷酸-葡萄糖6-磷酸-果糖1，6-二磷酸-果糖磷酸二羥丙酮3-磷酸-甘油醛.7/24/2023糖代謝的調(diào)節(jié)主要是能荷的調(diào)節(jié)，就是受細(xì)胞內(nèi)能量水平的控制。能荷：指細(xì)胞中ATP、ADP和AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸量度。能荷=

[ATP]+1/2[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]×100%

.7/24/2023能荷調(diào)節(jié)：指細(xì)胞通過(guò)改變ATP、ADP和AMP三者比例來(lái)調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)。當(dāng)體系中ATP含量高時(shí)，ATP抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，使糖酵解減少；當(dāng)需能反應(yīng)加強(qiáng)，ATP分解為ADP、AMP，ATP減少，ADP、AMP增加，ATP的抑制作用解除。.7/24/2023受能荷調(diào)節(jié)的酶系R代表ATP合成系統(tǒng)；U代表ATP消耗系統(tǒng).7/24/2023第一節(jié)厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控.7/24/20231.乙醇生產(chǎn)機(jī)制

酵母中，葡萄糖經(jīng)酵解途徑生成丙酮酸，無(wú)氧條件下，由丙酮酸脫羧酶催化作用，丙酮酸脫羧生成乙醛。丙酮酸丙酮酸脫羧酶乙醛+CO2乙醛NADH+H+→NADH+乙醇一、酵母菌的酒精發(fā)酵乙醇脫氫酶.7/24/2023(1)葡萄糖（glucose）EMP丙酮酸（pyruvicacid）己糖磷酸化作用EMP六碳糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿继橇姿岜潜?2)丙酮酸乙醇丙酮酸（pyruvicacid）丙酮酸脫羧酶乙醛（acetaldehyde）乙醛乙醇脫氫酶乙醇（alcohol）

由葡萄糖生成乙醇的總反應(yīng)式為

C6H12O6+2ADP+2H3PO4

2CH3CH2OH+2CO2+2ATP.7/24/2023G6-P-G6-P-果糖1,6-2-P-果糖3-P-甘油醛1,3-2-P-甘油酸3-P-甘油酸2-P-甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙醛乙醇NAD+NADH+H+酒精發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵乳酸.7/24/2023

2CH3COCOOH4ATPMg2+2ATP2CO22CH3CHONADH+H+NAD+C6H12O62C2H5OH

1、從Ｇ－－乙醇，無(wú)氧氣參與，是無(wú)氧呼吸過(guò)程。2、有脫氫反應(yīng)，脫下的氫由輔酶Ⅰ攜帶。還原型NADH+H+通過(guò)與乙醛反應(yīng)而重新被氧化的。3、從Ｇ－－乙醇，凈得２ATP。4、發(fā)酵過(guò)程的某些反應(yīng)需輔酶和輔助因子。.7/24/2023則1mol葡萄糖生成2mol乙醇，理論轉(zhuǎn)化率為2×46.05/180.1×100%=51.1%但是在生產(chǎn)中大約有5%的葡萄糖用于合成酵母細(xì)胞和副產(chǎn)物，實(shí)際上乙醇生成量約為理論值的95%，則乙醇對(duì)糖的實(shí)際轉(zhuǎn)化率約為48.5%。酵母菌在無(wú)氧的條件下，通過(guò)以上12步反應(yīng)，1分子G生成２分子的乙醇，２分子的CO2和2分子ATP。.7/24/2023通風(fēng)（有氧呼吸）缺氧（發(fā)酵）酒精生成量耗糖量/單位時(shí)間細(xì)胞的繁殖低（接近零）少旺盛高多很弱至消失巴斯德效應(yīng)(ThePasteureffect)現(xiàn)象：通風(fēng)對(duì)酵母代謝的影響.7/24/2023好氣條件下，酵母發(fā)酵力降低，這個(gè)事實(shí)稱為巴斯德效應(yīng)。糖代謝降低，發(fā)酵積累產(chǎn)物減少。一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)是磷酸果糖激酶，是變構(gòu)酶，底物是磷酸果糖+ATP。它受ATP、檸檬酸及其他高能化合物所抑制；受ADP、AMP激活；檸檬酸阻遏果糖激酶的合成，這種作用由于ATP的存在而加強(qiáng)。好氣條件下，糖代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)，形成檸檬酸，并通過(guò)氧化磷酸化生成大量ATP。.7/24/2023由于磷酸果糖受抑制，導(dǎo)致6-P-果糖積累，由于6-P-葡萄糖≒6-P-果糖反應(yīng)平衡時(shí)，醛糖：酮糖=7：3，導(dǎo)致6-P-葡萄糖積累；6-P-葡萄糖反饋抑制己糖激酶，抑制葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，最終導(dǎo)致葡萄糖利用降低。好氣條件下，丙酮酸激酶活性降低，由于其激活劑（磷酸果糖激酶催化生成的1，6-2P-果糖）減少，導(dǎo)致PEP積累，過(guò)量PEP反饋抑制己糖激酶的活性，從而也降低糖的酵解速度。.7/24/20232.酒精發(fā)酵中副產(chǎn)物的生成酒精發(fā)酵中，主要產(chǎn)物是乙醇和二氧化碳，同時(shí)還伴隨著40多種副產(chǎn)物，主要醇、醛、酸和酯等。副產(chǎn)物生成一方面耗用糖分，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。為使糖最大限度的用于合成乙醇和提高產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)減少副產(chǎn)物生成。

.7/24/2023（1）高級(jí)醇的生成

高級(jí)醇是碳原子數(shù)大于2的脂肪族醇類(lèi)的統(tǒng)稱，主要由正丙醇、異丁醇（2-甲基-1-丙醇）、異戊醇（3-甲基-1-丁醇）和活性戊醇（2-甲基-1-丁醇）。.7/24/2023①酒精發(fā)酵中高級(jí)醇形成途徑CH3HC-CH3CH2HC-NH2COOH亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶CH3HC-CH3CH2C=OCOOHΑ-酮異己酸CH3HC-CH3CH2HC=OCO2異戊醛醇脫氫酶CH3HC-CH3CH2H2COH異戊醇a.氨基酸氧化脫氨作用

.7/24/2023CH3HC-CH3HC-NH2COOH纈氨酸CH3HC-CH3H2COH異丁醇異亮氨酸活性戊醇酪氨酸酪醇苯乙醇苯丙氨酸b.由葡萄糖直接形成活性乙醛葡萄糖→α-酮酸→高級(jí)α-酮酸高級(jí)醇脫羧.7/24/2023②影響高級(jí)醇形成的條件a.菌種不同菌種的雜醇油生成量相差很大。b.培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基中分支鏈氨基酸（Leu、Ile、Val）存在，通過(guò)埃利希反應(yīng)增加相應(yīng)的高級(jí)醇的生成量。

培養(yǎng)基中氮水平高，則形成雜醇油量少。酵母菌自身的生長(zhǎng)將葡萄糖降解為酮酸，當(dāng)無(wú)機(jī)氮豐富時(shí)，生成的酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氨基酸，用于合成蛋白質(zhì)，使酮酸量減少；缺少氮源條件下，酮酸無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)榘被?，過(guò)量的酮酸脫羧還原生成少一個(gè)碳原子的高級(jí)醇。.7/24/2023c.發(fā)酵條件發(fā)酵溫度高，高級(jí)醇生成量高；通風(fēng)有利于高級(jí)醇生成；高級(jí)醇生成與乙醇生成是平行的，隨乙醇的生成而生成。.7/24/2023（2）琥珀酸(丁二酸)的生成添加谷氨酸增加琥珀酸產(chǎn)量（3）酯類(lèi)的生成發(fā)酵產(chǎn)物中醇類(lèi)和酸類(lèi)經(jīng)酯化反應(yīng)生成多種酯類(lèi)。（4）糠醛、甲醇等生成糠醛是用淀粉原料在高壓高溫煮時(shí)，由糖脫水生成。甲醇是原料中的果膠質(zhì)受果膠酯酶水解生成的。.7/24/2023二、細(xì)菌的酒精發(fā)酵（alcoholicfermentationofbacteria)

菌種為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌（ZymomonasMobilis），少數(shù)假單胞桿菌（Pseudomonas），如林氏假單胞菌（Ps.lindneri）能利用G經(jīng)ED途徑進(jìn)行酒精發(fā)酵?？偡磻?yīng)式為

C6H12O6+ADP+H3PO4→2C2H5OH+2CO2+ATP產(chǎn)物和酵母菌的酒精發(fā)酵相同，但產(chǎn)能水平各異。

.7/24/2023ED途徑①②②②③特征酶.7/24/2023

在ED途徑中生成的2分子丙酮酸脫羧生成乙醛，乙醛還原生成乙醇。在末端假單胞菌中能使2分子丙酮酸脫羧，然后還原乙醛生成2分子乙醇和2分子CO2；而在其他假單胞菌中氫載體再氧化后，生成1分子的乙醇、1分子乳酸和1分子CO2。.7/24/2023

細(xì)菌酒精發(fā)酵的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

代謝速度快；發(fā)酵周期短，比酵母菌的酒精產(chǎn)率高；厭氧且耐高溫；能利用多種糖類(lèi)缺點(diǎn)：發(fā)酵工藝技術(shù)要求高.7/24/2023三、乳酸發(fā)酵乳酸細(xì)菌能利用葡萄糖及其他相應(yīng)的可發(fā)酵的糖產(chǎn)生乳酸，稱為乳酸發(fā)酵。由于菌種不同，代謝途徑不同，生成的產(chǎn)物有所不同，將乳酸發(fā)酵又分為同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵：（經(jīng)EMP途徑）異型乳酸發(fā)酵：（經(jīng)HMP途徑）雙歧桿菌發(fā)酵:（經(jīng)HK途徑—磷酸己糖解酮酶途徑）.7/24/2023葡萄糖1，6-二磷酸果糖磷酸二羥柄酮3-磷酸甘油醛1.3-二磷酸甘油酸NAD+NADH+H+乳酸丙酮酸乳酸脫氫酶能進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的細(xì)菌主要有：乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌等。①同型乳酸發(fā)酵概念菌種途徑特點(diǎn).7/24/2023②異型乳酸發(fā)酵2ADP2ATP概念菌種途徑特點(diǎn)-CO23-磷酸甘油醛乳酸乙酰磷酸-2H葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸木酮糖NAD+NADHNAD+NADHATPADP乙醇乙醛乙酰CoA.7/24/2023雙歧(btfidus)途徑

.7/24/2023.7/24/2023

微生物的代謝途徑一般都不是單一的，因此，不論同型乳酸發(fā)酵還是異型乳酸發(fā)酵，實(shí)際代謝產(chǎn)物都不象代謝途徑中那樣單純，所以，兩類(lèi)乳酸發(fā)酵的代謝產(chǎn)物沒(méi)有不可逾越的界限。在微生物的分類(lèi)研究中，通常把發(fā)酵1mol葡萄糖產(chǎn)生的乳酸少于1.8mol，同時(shí)還產(chǎn)生較多的乙醇、CO2或乙酸、甘油、甘露醇等產(chǎn)物的乳酸菌稱為異型乳酸菌。同型乳酸菌發(fā)酵的微生物已經(jīng)用來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。異型乳酸發(fā)酵的微生物，例如雙歧桿菌，已經(jīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)活菌飲料，并越來(lái)越受重視。.7/24/2023四、甘油發(fā)酵葡萄糖1，6-二磷酸果糖磷酸二羥柄酮3-磷酸甘油醛乙醛1.3-二磷酸甘油酸NAD+NADH+H+乙醇丙酮酸乙醇脫氫酶NAD+NADH+H+α-磷酸甘油甘油α-磷酸甘油磷酸酯酶+NaHSO3乙醛亞硫酸氫鈉加成物1.亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵.7/24/2023培養(yǎng)基中含有亞硫酸氫鈉時(shí)，乙醛與之發(fā)生反應(yīng)不能作為氫受體，而由磷酸二羥丙酮作為氫受體，生成大量甘油。該過(guò)程也稱酵母菌的II型發(fā)酵。實(shí)際上甘油發(fā)酵中，仍有一些乙醇生成，因?yàn)閬喠蛩釟溻c加的太多會(huì)使酵母中毒。未被亞硫酸氫鈉結(jié)合的的乙醛還可轉(zhuǎn)化為乙醇。.7/24/2023當(dāng)酵母在堿性（pH7.6）條件下發(fā)酵時(shí)，乙醛也不能作為氫受體，兩個(gè)乙醛分子起岐化反應(yīng)，生成等量的乙醇和乙酸，此時(shí)仍是磷酸二羥丙酮作氫受體，產(chǎn)生甘油。這種發(fā)酵稱為酵母第三型發(fā)酵。2C6H12O6+H2O→2甘油+乙醇+乙酸+CO2堿法甘油發(fā)酵的產(chǎn)品有甘油、乙醇、乙酸，也不產(chǎn)生ATP，所以此法只能在酵母的非生長(zhǎng)情況下進(jìn)行發(fā)酵。2.堿法甘油發(fā)酵.7/24/2023沼氣發(fā)酵機(jī)制沼氣（biogas）(甲烷，methane)

甲烷發(fā)酵屬于厭氧消化(anaerobicdigestion)處理，是有機(jī)物厭氧分解過(guò)程中的主要過(guò)程。利用厭氧菌將工廠廢水、下水污泥中所含有的有機(jī)物進(jìn)行分解，不用對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌和純種培養(yǎng)和接種操作。它可以作為好氧處理的前階段處理。甲烷氣體（沼氣）是生物燃?xì)獾闹饕蓡T。

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一、甲烷發(fā)酵機(jī)理

甲烷發(fā)酵是厭氧菌將碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的有機(jī)物最終分解成甲烷和CO2，甲烷發(fā)酵不是由單一的甲烷產(chǎn)生菌所能完成的，甲烷發(fā)酵至少由三個(gè)階段組成：

第一個(gè)階段是有機(jī)聚合物水解生成單體化合物，進(jìn)而分解成各種脂肪酸、CO2和H2；第二階段是各類(lèi)脂肪酸進(jìn)行分解，生成乙酸、CO2和H2；第三個(gè)階段是由乙酸和CO2及H2反應(yīng)生成甲烷；前兩個(gè)階段也可統(tǒng)稱為產(chǎn)酸階段，產(chǎn)酸階段也叫液化階段，參與這一階段反應(yīng)的微生物大部分是兼性厭氧細(xì)菌，只有少數(shù)的原生動(dòng)物、霉菌和酵母參與這一反應(yīng)。發(fā)酵液中這一類(lèi)非甲烷產(chǎn)生菌的數(shù)量大體上與甲烷產(chǎn)生菌相等。

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復(fù)雜有機(jī)物

←發(fā)酵細(xì)菌

可溶性簡(jiǎn)單有機(jī)物

←產(chǎn)酸菌

揮發(fā)性脂肪酸（丙酸，異丁酸，異戊酸）專(zhuān)性質(zhì)子還原菌醋酸H2+HCO3純醋酸菌CH4甲烷菌CH4

HCO3H+HCO3H2CO3H2O+CO2H2O.7/24/2023

復(fù)雜的有機(jī)物受到各類(lèi)微生物(biogasproducingbacteria)的作用，生成簡(jiǎn)單的可溶性有機(jī)物，可溶性有機(jī)物經(jīng)產(chǎn)酸菌的代謝生H2、醋酸和其它脂肪酸（3~5碳），丙酸等3~5個(gè)碳的脂肪酸，不能直接被甲烷菌轉(zhuǎn)化生成甲烷，而先要有一種專(zhuān)性質(zhì)子還原菌或醋酸菌將它們轉(zhuǎn)化為醋酸和氫。甲烷菌將H2、HCO3（生成碳酸鹽）或醋酸轉(zhuǎn)化為甲烷（CH4），并產(chǎn)生ATP。

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生成碳酸鹽在溶液中和碳酸相平衡，后者與溶解態(tài)的CO2相平衡，液相CO2又與氣相CO2相平衡。最終的產(chǎn)物是生物氣體（CH4+CO2）。兩者比例與基質(zhì)、細(xì)菌分解途徑、pH、和發(fā)酵液的緩沖能力有關(guān)，CH4占的比例為50%~90%。.7/24/2023

二、甲烷發(fā)酵的微生物

產(chǎn)酸階段也叫液化階段，參與的微生物大部分是兼性厭氧菌，只有少量的原生動(dòng)物、霉菌和酵母參與這一反應(yīng)。

產(chǎn)酸階段的細(xì)菌有：梭菌屬（Clostridium）；芽孢桿菌（Bacillus）；葡萄球菌屬（Staphlococccus）；變形桿菌屬（Froteis）；桿菌屬(Bacterium)。

甲烷產(chǎn)生階段主要是甲烷產(chǎn)生菌參與。甲烷菌是嚴(yán)格厭氧菌，不產(chǎn)孢子。采用新的厭氣培養(yǎng)技術(shù)，可以分離得到20種以上的甲烷產(chǎn)生菌。

.7/24/2023產(chǎn)甲烷桿菌（Methanobacterium）；