抗原決定簇的確立和選擇培訓(xùn)課件

抗原決定簇的確立和選擇抗原表位--定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenicdeterminant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，因而表位代表了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，抗體的特異性是針對(duì)表位而不是針對(duì)完整的抗原分子的?？乖ㄟ^(guò)抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答；抗原也借表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)?？乖砦坏男再|(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)型決定抗原的特異性。2抗原決定簇的確立和選擇抗原分子以其B細(xì)胞表位與抗體分子的抗原結(jié)合部位發(fā)生互補(bǔ)性結(jié)合A.抗原--抗體復(fù)合物的立體構(gòu)象；B.采用電腦技術(shù)將抗原和抗體分子分開(kāi)，可見(jiàn)抗原和抗體分子的相互作用僅發(fā)生在抗原分子的B細(xì)胞表位和抗體分子的抗原結(jié)合部位之間，兩者呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。C.抗體的互補(bǔ)決定區(qū)與抗原表位結(jié)合示意圖C3抗原決定簇的確立和選擇一般情況下，一個(gè)多肽表位含5~6個(gè)氨基酸殘基；一個(gè)多糖表位含5~7個(gè)單糖；一個(gè)核酸半抗原的表位含6~8個(gè)核苷酸。抗原表位的大小與相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相適合。一個(gè)抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定，但其中有些殘基在與抗體結(jié)合時(shí)比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團(tuán)。

4抗原決定簇的確立和選擇抗原表位--分類覆蓋型和非覆蓋型表位

某些抗原分子表面，不同表位之間相對(duì)分離，各自結(jié)合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。若某一表位與相應(yīng)抗體結(jié)合會(huì)影響另一表位與抗體的結(jié)合，此類表位稱為覆蓋型表位。

功能性和隱蔽表位

位于抗原分子表面的表位易被相應(yīng)淋巴細(xì)胞所識(shí)別，即具有易接近性，可直接啟動(dòng)免疫應(yīng)答，故稱為功能性表位。存在于抗原分子內(nèi)部的表位無(wú)直接觸發(fā)免疫應(yīng)答的功能，稱為隱蔽表位。若通過(guò)理化因素處理抗原，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部的隱蔽表位被暴露，可能成為新的有功能的表位。

5抗原決定簇的確立和選擇按表位結(jié)構(gòu)不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位。連續(xù)性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成通常這種結(jié)合比較弱，因?yàn)樾‰牟⒉缓暾烊坏鞍椎臉?gòu)象，在多數(shù)情況下這種表位可能只代表了復(fù)雜表位的一部分。對(duì)其研究依賴于多肽固相化學(xué)合成技術(shù)。后者又稱構(gòu)象型抗原表位，是由那些空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成。

分類6抗原決定簇的確立和選擇

按照與抗原受體細(xì)胞結(jié)合不同，分為B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位。分類特性T細(xì)胞表位B細(xì)胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無(wú)需表位性質(zhì)主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有機(jī)化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個(gè)氨基酸，5-7個(gè)單糖或5-7個(gè)核苷酸表位類型線性表位構(gòu)象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面7抗原決定簇的確立和選擇研究意義表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)抗原表位，對(duì)于設(shè)計(jì)具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應(yīng)用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特異性診斷試劑盒中更為重要。8抗原決定簇的確立和選擇抗原表位研究方法通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起陽(yáng)性反應(yīng)的片段。1.1用化學(xué)法或酶“切割”抗原，分離抗原肽段該法對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不作要求，但測(cè)定結(jié)果只能是抗原的線性表位?；瘜W(xué)切割法中常用的試劑：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8蛋白酶等。水解后采用各種分離方法如SDS-PAGE、凝膠過(guò)濾、離子交換將水解片段分開(kāi)，然后用Westernblot，ELISA等各種檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)。結(jié)果可通過(guò)理論肽段分子量的推斷或相應(yīng)的氨基酸序列分析來(lái)判斷。利用該法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌細(xì)胞增強(qiáng)蛋白、乙酰膽堿酯酶、玻璃體結(jié)合蛋白、磷脂酶基質(zhì)蛋白等。1.傳統(tǒng)化學(xué)“切割”法或酶法（classicalepitopemapping）9抗原決定簇的確立和選擇研究方法1.2水解抗原-抗體復(fù)合物這是一個(gè)直接的確定線性及構(gòu)象性抗原表位的方法，又稱為Proteinfootprinting。其理論依據(jù)為抗原--抗體復(fù)合物的結(jié)合部位能抵抗蛋白酶的水解。根據(jù)蛋白質(zhì)抗原性質(zhì)的不同常采用3種方法。對(duì)于蛋白酶水解位點(diǎn)較少的抗原，一般先將抗原與等摩爾抗體在PBS中反應(yīng)，然后酶解，SDS分離水解產(chǎn)物，分析結(jié)果。對(duì)于蛋白酶水解位點(diǎn)較多的抗原，采用HPLC法，將抗原--抗體復(fù)合物的酶解片段和同樣條件下的抗原酶解片段分別用HPLC分析。兩者圖譜對(duì)應(yīng)峰峰高比大于平均數(shù)值的片段則推測(cè)為抗原表位。對(duì)于能確定為線性表位的抗原可先將抗體連接于固相載體上，并將此固相載體裝柱，然后讓過(guò)量的抗原溶液通過(guò)此柱，使抗原-抗體形成復(fù)合物。一定條件下，酶溶液過(guò)柱，酶解此抗原-抗體復(fù)合物，PBS洗去酶解下的不結(jié)合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下與抗體結(jié)合的肽段。HPLC分析這些片段以確定結(jié)果。近來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)在這類結(jié)果分析中得到了廣泛的應(yīng)用。采用該法已成功地確定了細(xì)胞色素C，胃泌素釋放肽(GRP)，脂堿性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。10抗原決定簇的確立和選擇2.合成肽庫(kù)方法有機(jī)合成法就是直接利用固相肽合成技術(shù)，合成含有各種可能序列的短肽。通過(guò)這種合成可以保證各種序列的多肽等機(jī)率出現(xiàn)，每個(gè)載體上只含有一種序列的短肽。優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，迅速。缺點(diǎn)是不能擴(kuò)增，篩選比較麻煩，需進(jìn)行熒光標(biāo)記或ELISA，在顯微鏡下操作工作量比較大。在研究構(gòu)象性表位時(shí)的minotopes方法即采用類似的方法，通常從二肽開(kāi)始合成并逐漸增加肽鏈長(zhǎng)度及置換氨基酸種類，直至達(dá)到與抗體的最大結(jié)合為止。研究方法2.1有機(jī)合成法肽庫(kù)是大量某一長(zhǎng)度(如六肽)的短肽的集合，它包括了該長(zhǎng)度的短肽的各種可能序列或其中的絕大部分。11抗原決定簇的確立和選擇該法先利用基因克隆技術(shù)將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達(dá)。再利用生物素或酶標(biāo)記的抗體篩出特異的噬菌體，并進(jìn)行擴(kuò)增，再篩選，從結(jié)合特異抗體的噬菌體DNA序列推斷出氨基酸序列，并合成相應(yīng)的短肽，驗(yàn)證篩選結(jié)果。用此法檢測(cè)的抗原表位有人H鐵蛋白、藍(lán)舌病病毒的外殼蛋白VP5等。研究方法2.2

基因工程法（噬菌體隨機(jī)肽篩選法）12抗原決定簇的確立和選擇此技術(shù)于1992年由R.Frank發(fā)展出來(lái)，它主要是將涵蓋所有抗原氨基酸序列的縮氨酸合成于固定的表面，并與抗血清標(biāo)定，此法可鑒定線性抗原表位。應(yīng)用肽合成技術(shù)合成連續(xù)的重疊的5～7肽，將這些合成的肽與相應(yīng)的抗體反應(yīng)，分析檢測(cè)結(jié)果，以確定陽(yáng)性反應(yīng)片段。這一技術(shù)要求有明確的抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并且檢測(cè)結(jié)果為抗原線性表位。該法應(yīng)用廣泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生蟲(chóng)蛋白、煙草花葉病毒(TMV)、Fy6蛋白、鴨肝炎B病毒(DHBV)等。

3縮氨酸掃描技術(shù)(PeptideScantechnology)研究方法13抗原決定簇的確立和選擇4表位作圖早期表位作圖或定位(epitopemapping)是基于蛋白質(zhì)修飾和降解的原理，可經(jīng)側(cè)鏈化學(xué)修飾法選擇性地標(biāo)記氨基酸，失去結(jié)合的部分將被測(cè)出。蛋白質(zhì)抗原被降解為小片段，經(jīng)測(cè)序后確定抗體結(jié)合的位點(diǎn)。要確定某一抗原的全部表位需要大量的時(shí)間。現(xiàn)已可以通過(guò)誘變、蛋白質(zhì)合成或蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方法鑒定其表位。此外，表位序列測(cè)定的應(yīng)用對(duì)抗體結(jié)合表位的分析具有顯著的優(yōu)越性。研究方法14抗原決定簇的確立和選擇研究方法--表位作圖方法構(gòu)象表位線性表位條件精確度競(jìng)爭(zhēng)分析方法是，但并非經(jīng)常是標(biāo)記抗體、抗原僅確定空間位置競(jìng)爭(zhēng)基因片段表達(dá)法是，但并非經(jīng)常是必須克隆，DNA(已知基因序列)構(gòu)象50-200個(gè)氨基酸線狀10-20個(gè)氨基酸合成肽庫(kù)法否是必須建立肽庫(kù)完全繪制3-15推薦使用表位作圖方法和基本條件15抗原決定簇的確立和選擇研究方法從80年代Hopp和Woods提出親水性參數(shù)對(duì)抗原表位預(yù)測(cè)的方法以來(lái)，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，對(duì)B細(xì)胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動(dòng)作用。現(xiàn)已被大眾認(rèn)可并具有較好預(yù)測(cè)效果的方法，主要有以下6種：5抗原表位的預(yù)測(cè)法16抗原決定簇的確立和選擇(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性參數(shù)，指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性。它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)法18抗原決定簇的確立和選擇(3)抗原性方案(Antigenicity)對(duì)20個(gè)已研究得很透的蛋白質(zhì)的69個(gè)連續(xù)位點(diǎn)的606個(gè)氨基酸統(tǒng)計(jì)分析，Welling建立了抗原性刻度。每個(gè)氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)的頻率描述，此頻率除以各氨基酸在所有蛋白質(zhì)中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明，疏水性氨基酸殘基對(duì)抗原表位形成亦有貢獻(xiàn)。缺點(diǎn)是其所用的數(shù)據(jù)庫(kù)有限，并且連續(xù)位點(diǎn)內(nèi)的殘基被認(rèn)為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計(jì)算會(huì)明顯降低相關(guān)性。抗原表位的預(yù)測(cè)法19抗原決定簇的確立和選擇(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動(dòng)性，活動(dòng)性強(qiáng)的氨基酸殘基即可塑性大的位點(diǎn)，易形成抗原表位。Karplas和Schulz基于已知結(jié)構(gòu)的31個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)展了一種預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)片段活動(dòng)性的方法。(5)電荷分布方案(Chargedistribution)認(rèn)為對(duì)堿性抗原特異的抗體多趨于酸性，對(duì)酸性抗原特異的抗體多趨于堿性?？乖砦坏念A(yù)測(cè)法20抗原決定簇的確立和選擇(6)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案(Secondarystructure)認(rèn)為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。而α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，較難嵌和抗體，一般不作為抗原表位?？深A(yù)測(cè)蛋白質(zhì)β轉(zhuǎn)角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各種方法預(yù)測(cè)的成功率均不超過(guò)65%。一般認(rèn)為Cohen方法對(duì)轉(zhuǎn)角的預(yù)測(cè)正確率很高，對(duì)于已知折疊類型的蛋白質(zhì)(αα類，ββ類，α/β類)正確率高達(dá)95%，對(duì)于未知結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)，可用3種類型分別預(yù)測(cè)，3類預(yù)測(cè)一致的轉(zhuǎn)角對(duì)預(yù)測(cè)表位有幫助?？乖砦坏念A(yù)測(cè)法21抗原決定簇的確立和選擇對(duì)上述各種參數(shù)的預(yù)測(cè)比較表明，各種方案預(yù)測(cè)的正確率均不高。一般將上述多種方案綜合考慮，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為重要。已經(jīng)有一些文獻(xiàn)提出了各自不同的綜合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一種綜合預(yù)測(cè)方案。權(quán)重選擇為：40%來(lái)自二級(jí)結(jié)構(gòu)成分，可及性、柔韌性各15%，30%來(lái)自親水性。在吳加金等編的Goldkey軟件中，以六種參數(shù)Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，F(xiàn)lexibility，Charge，Antigenivity綜合考慮，得出綜合判斷圖，閾值以上的峰即認(rèn)為是預(yù)測(cè)的抗原表位。從軟件預(yù)測(cè)出的抗原表位須用實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證?？乖砦坏念A(yù)測(cè)法22抗原決定簇的確立和選擇以往合成的序列肽僅模擬蛋白質(zhì)的線性表位，這無(wú)疑會(huì)遺漏眾多的構(gòu)象性表位信息。近些年來(lái),隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和試驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行構(gòu)象性表位分析和定位得到了迅速發(fā)展，一些可用的基于Web的預(yù)測(cè)軟件已經(jīng)公布，如CEP軟件、DiscTope軟件和MEPS軟件。應(yīng)用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)建模進(jìn)行構(gòu)象性表位預(yù)測(cè)是另一類預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象性表位的方法。即利用抗體篩選噬菌體肽庫(kù)，獲取抗體親和性模擬肽，對(duì)模擬肽集合進(jìn)行比對(duì)處理，獲得探針基序，然后利用探針基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，獲得的序列即作為預(yù)測(cè)結(jié)果。1990年Scott首次將噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)應(yīng)用于抗原定位。目前提供的基于Web的預(yù)測(cè)服務(wù)算法有Pepitope算法、3DEX算法和MIMOX算法。B細(xì)胞構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)23抗原決定簇的確立和選擇T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)主要基于候選肽能否和MHC分子結(jié)合。T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分CTL表位預(yù)測(cè)和Th表位預(yù)測(cè)兩類,其中CTL表位預(yù)測(cè)主要涉及MHCⅠ類分子肽預(yù)測(cè),Th表位預(yù)測(cè)涉及MHCⅡ類分子的親和肽預(yù)測(cè)。與MHCⅠ類分子結(jié)合的多肽長(zhǎng)度通