微生物學(xué)格式微生物的生長及控制培訓(xùn)課件

第一節(jié)測定生長繁殖的方法一、測生長量二、計(jì)繁殖數(shù)1、直接法測體積法(粗放)稱干重法(精確)2、間接法比濁法：分光光度法(OD)生理指標(biāo)法：測含氮量7/23/20231微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1、直接法：用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)二、計(jì)繁殖數(shù)2、間接法：用平板菌落進(jìn)行的活菌計(jì)數(shù)菌數(shù)/mL=cfuX稀釋度X107/23/20232微生物學(xué)格式微生物的生長及控制第二節(jié)微生物的生長規(guī)律一、微生物的個(gè)體生長和同步生長三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)方法二、微生物的典型生長曲線7/23/20233微生物學(xué)格式微生物的生長及控制一、微生物的個(gè)體生長和同步生長同步生長通過同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)；獲得同步生長的方法環(huán)境條件誘導(dǎo)法機(jī)械篩選法

7/23/20234微生物學(xué)格式微生物的生長及控制二、微生物的典型生長曲線(growthcurve)生長曲線：當(dāng)把少量純種單細(xì)胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的溫度、通氣等體積下，該群體就會由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。如果以細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)就可畫出一條曲線——微生物的典型生長曲線。7/23/20235微生物學(xué)格式微生物的生長及控制培養(yǎng)時(shí)間(h)I延滯期II指數(shù)期III穩(wěn)定期IV衰亡期0生長速度總菌數(shù)活菌數(shù)IIIIIIIVlg細(xì)胞數(shù)(個(gè)/ml)二、微生物的典型生長曲線(growthcurve)7/23/20236微生物學(xué)格式微生物的生長及控制Ⅰ延滯期(lagphase)⑤對外界不良條件例如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學(xué)藥物的反應(yīng)敏感。指少量微生物接種到新鮮培養(yǎng)液中后，在開始培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不增加的時(shí)期。①生長速率常數(shù)R等于零。②細(xì)胞形態(tài)變大或增長。③細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性。④合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。7/23/20237微生物學(xué)格式微生物的生長及控制影響延滯期長短的因素（1）接種齡（2）接種量（3）培養(yǎng)基成分Ⅰ延滯期(lagphase)出現(xiàn)延滯期的原因？7/23/20238微生物學(xué)格式微生物的生長及控制Ⅱ指數(shù)期(exponentialphase)是指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時(shí)期。①生長速率常數(shù)R最大，代時(shí)G最短；②整個(gè)群體的生理特性較一致；④酶系活躍，代謝旺盛。③細(xì)胞各成分平衡增長，生長速率恒定；7/23/20239微生物學(xué)格式微生物的生長及控制三個(gè)重要參數(shù)（1）繁殖代數(shù)(n)（2）生長速率常數(shù)(R)（3）代時(shí)(G)Ⅱ指數(shù)期(exponentialphase)7/23/202310微生物學(xué)格式微生物的生長及控制G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)

X2=X1·2n兩邊取對數(shù)：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)Ⅱ指數(shù)期(exponentialphase)x2x1t1t27/23/202311微生物學(xué)格式微生物的生長及控制影響代時(shí)長短的因素（1）菌種（2）營養(yǎng)成分（3）營養(yǎng)物濃度（4）培養(yǎng)溫度細(xì)胞數(shù)或菌體量時(shí)間8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml營養(yǎng)物濃度對生長速度和菌體產(chǎn)量的影響Ⅱ指數(shù)期(exponentialphase)7/23/202312微生物學(xué)格式微生物的生長及控制Ⅲ穩(wěn)定期(stationaryphase)①生長速率常數(shù)R=0，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等；②菌體產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，且產(chǎn)量與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗出現(xiàn)有規(guī)律的比例關(guān)系，用生長產(chǎn)量常數(shù)Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0

X：穩(wěn)定期的細(xì)胞干重(g/ml培養(yǎng)液）X0：剛接種時(shí)的細(xì)胞干重C0

：限制性營養(yǎng)物的最初濃度(g/ml)C：穩(wěn)定時(shí)期限制性營養(yǎng)物的濃度7/23/202313微生物學(xué)格式微生物的生長及控制③通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建；①對以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物(SCP、乳酸)等為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期：②是對維生素、堿基和氨基酸等生長因子進(jìn)行生物測定的最佳測定時(shí)期；穩(wěn)定期的實(shí)踐意義7/23/202314微生物學(xué)格式微生物的生長及控制IV衰亡期(deathphase)微生物個(gè)體死亡速度超過新生速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長狀態(tài)；細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)畸形；有的發(fā)生自溶；有的合成或釋放次生代謝產(chǎn)物；芽孢此期釋放；7/23/202315微生物學(xué)格式微生物的生長及控制三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)方法穩(wěn)定期到來的主要原因？營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；有害代謝產(chǎn)物的累計(jì)；理化條件的不適宜等；7/23/202316微生物學(xué)格式微生物的生長及控制是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，使細(xì)菌培養(yǎng)液保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法；主要用于獲得大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物。1.恒濁器(turbidostat)7/23/202317微生物學(xué)格式微生物的生長及控制2、恒化器(chemostat)是一種設(shè)法使培養(yǎng)液的流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率的條件下進(jìn)行繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置；主要獲得不同生長速率的菌體；7/23/202318微生物學(xué)格式微生物的生長及控制

恒濁與恒化培養(yǎng)控制裝置7/23/202319微生物學(xué)格式微生物的生長及控制裝置恒濁器恒化器控制對象菌體密度(內(nèi)控制)培養(yǎng)基流速(外控制)培養(yǎng)基無限制生長因子有限制生長因子培養(yǎng)基流速不恒定恒定生長速率最高速率低于最高速率產(chǎn)物大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物不同生長速率的菌體應(yīng)用范圍生產(chǎn)為主實(shí)驗(yàn)室為主Turbidostat&chemostat的比較7/23/202320微生物學(xué)格式微生物的生長及控制分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)的比較7/23/202321微生物學(xué)格式微生物的生長及控制連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)高效自控產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定節(jié)約動(dòng)力、人力、水和蒸汽等缺點(diǎn)菌種容易退化容易污染雜菌營養(yǎng)物的利用率低于單批培養(yǎng)7/23/202322微生物學(xué)格式微生物的生長及控制微生物的高密度培養(yǎng)指微生物在液體培養(yǎng)中細(xì)胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)；目前由于研究的微生物種類主要局限于E.coliandS.cerevisiae等兼性厭氧菌；7/23/202323微生物學(xué)格式微生物的生長及控制第三節(jié)影響微生物生長的主要因素一、溫度二、氧氣三、pH值7/23/202324微生物學(xué)格式微生物的生長及控制一、溫度(temperature)7/23/202325微生物學(xué)格式微生物的生長及控制嗜冷菌

(<20oC)

嗜溫菌

(20-45oC)

嗜熱菌

(50-60oC)嗜高溫菌

(80-95oC)

極端高溫菌(105-150oC)根據(jù)溫度對微生物的影響分類7/23/202326微生物學(xué)格式微生物的生長及控制ThermophileandBiotechnology來自嗜熱菌的酶可在高溫下穩(wěn)定的催化生物化學(xué)反應(yīng)；其中由Thermus

aquaticus

中分離出來的

DNA聚合酶，Taqpolymerase，已廣泛應(yīng)用于PCR反應(yīng)；分離自Pyrocuccus

furiosus

的pfupolymerase應(yīng)用于PCR反應(yīng)更加穩(wěn)定，而且錯(cuò)誤率更低；7/23/202327微生物學(xué)格式微生物的生長及控制二、氧氣(oxygen)好氧菌(Aerobes)1.專性好氧菌(obligateaerobes)必須有氧存在2.兼性好氧菌(facultativeaerobes)有氧無氧均可，但有氧更好3.微好氧菌(microaerophilicaerobes)只在較低的氧分壓下生長

厭氧菌(anaerobes)4.耐氧菌(aerotolerantanaerobes)不需氧，但有氧也能生存，氧無毒害5.專性厭氧菌(obligate/strictanaerobes)氧有毒害，甚至致死7/23/202328微生物學(xué)格式微生物的生長及控制微生物與氧的關(guān)系7/23/202329微生物學(xué)格式微生物的生長及控制厭氧菌的氧毒害機(jī)制厭氧菌體內(nèi)無SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物體內(nèi)普遍存在的超氧陰離子自由基的毒害作用。7/23/202330微生物學(xué)格式微生物的生長及控制去除·O2-等有害活性氧分子的機(jī)制H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌過氧化氫酶一切好氧生物NADH2NAD過氧化物酶耐氧菌7/23/202331微生物學(xué)格式微生物的生長及控制三、pH值嗜堿微生物（basophile）多數(shù)放線菌、硝化細(xì)菌、根瘤菌等耐堿微生物（basotolerantmicroorganism）若干鏈霉菌嗜酸微生物（acidophile）多數(shù)真菌耐酸微生物(acidotolerantmicroorganism)乳酸桿菌、醋酸桿菌，許多腸桿菌等7/23/202332微生物學(xué)格式微生物的生長及控制第四節(jié)微生物培養(yǎng)方法概論微生物培養(yǎng)方法生產(chǎn)實(shí)踐實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法固體培養(yǎng)好氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)液體培養(yǎng)好氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)固體培養(yǎng)好氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)液體培養(yǎng)好氧菌的培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)7/23/202333微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1、好氧菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)固體培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)皿瓊脂平板液體培養(yǎng)試管液體培養(yǎng)三角瓶淺層液體培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)（振蕩培養(yǎng)）臺式發(fā)酵罐培養(yǎng)7/23/202334微生物學(xué)格式微生物的生長及控制2、厭氧菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)高層瓊脂柱7/23/202335微生物學(xué)格式微生物的生長及控制Hungate滾管7/23/202336微生物學(xué)格式微生物的生長及控制厭氧罐技術(shù)7/23/202337微生物學(xué)格式微生物的生長及控制厭氧手套箱7/23/202338微生物學(xué)格式微生物的生長及控制第五節(jié)有害微生物的控制一、幾個(gè)基本概念7/23/202339微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1、滅菌(sterilization)采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。例如各種高溫滅菌措施等?？偩鷶?shù)活菌數(shù)細(xì)胞數(shù)的對數(shù)細(xì)胞數(shù)的對數(shù)時(shí)間時(shí)間殺菌溶菌7/23/202340微生物學(xué)格式微生物的生長及控制2、消毒(disinfection)消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。舉例：一些常用的對皮膚、水果、飲用水進(jìn)行藥劑消毒的方法；對啤酒、牛奶、果汁和醬油等進(jìn)行消毒處理的巴氏消毒法等；7/23/202341微生物學(xué)格式微生物的生長及控制3、防腐(antisepsis)防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。防腐的常用措施低溫缺氧干燥高滲高酸度防腐劑7/23/202342微生物學(xué)格式微生物的生長及控制4、化學(xué)治療(chemotherapy)它是利用具有高度選擇毒力（selectivetoxicity，即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑；一些重要的化學(xué)治療劑種類：各種抗生素磺胺類藥物中草藥中的有效成分等7/23/202343微生物學(xué)格式微生物的生長及控制比較項(xiàng)目滅菌消毒防腐化療處理因素強(qiáng)理、化因素理、化因素理、化因素化學(xué)治療劑處理對象任何物體內(nèi)外的一切微生物物體表面的病原菌物體內(nèi)外的一切微生物宿主體內(nèi)的病原菌作用效果徹底殺滅殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實(shí)例加壓蒸汽滅菌，輻射滅菌，殺菌劑70%酒精消毒，巴氏消毒法冷藏、干燥、糖漬、鹽腌、缺氧、防腐劑抗生素、磺胺藥、生物藥物素滅菌、消毒、防腐和化療的比較7/23/202344微生物學(xué)格式微生物的生長及控制（一）物理方法——高溫殺菌高溫滅菌干熱滅菌法火焰灼燒法烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法濕熱滅菌(消毒)法常壓下加壓下巴氏消毒法煮沸消毒法間歇滅菌法常規(guī)加壓滅菌法連續(xù)加壓滅菌法LTH法HTST法7/23/202345微生物學(xué)格式微生物的生長及控制烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法

150~170℃1~2h徹底殺滅細(xì)菌；

適用于金屬和玻璃器皿的滅菌；火焰灼燒法僅適用于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動(dòng)物尸體的燒毀等。干熱滅菌法7/23/202346微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1、熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)；2、熱蒸汽比熱空氣穿透力更強(qiáng)；3、蒸汽存在潛熱，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變成液體時(shí)可放出大量熱量；4、可迅速提高滅菌物體的溫度。相同溫度下，濕熱滅菌比干熱滅菌好；濕熱滅菌法7/23/202347微生物學(xué)格式微生物的生長及控制比較項(xiàng)目干熱90℃90℃相對濕度20%80%白喉棒桿菌24h2h2min痢疾桿菌3h2h2min傷寒桿菌3h2h2min葡萄球菌8h3h2min干熱與濕熱空氣對不同細(xì)胞的致死時(shí)間7/23/202348微生物學(xué)格式微生物的生長及控制巴氏消毒法一種低溫濕熱消毒法。低溫維持法(Lowtemperatureholdingmethod,LTH)63℃30min高溫瞬時(shí)法(Hightemperatureshorttime,HTST)72℃15s巴氏消毒法7/23/202349微生物學(xué)格式微生物的生長及控制間歇滅菌法(fractionalsterilization)

80~100℃15~60min殺滅所有微生物的營養(yǎng)體；

37℃

或室溫保溫過夜，誘發(fā)芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)體；重復(fù)上述步驟三次，在較低的滅菌溫度下徹底滅菌；適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。7/23/202350微生物學(xué)格式微生物的生長及控制高壓蒸汽滅菌法

121℃

；15-20min；1kg/cm2

是被廣泛使用的方法；7/23/202351微生物學(xué)格式微生物的生長及控制高壓蒸汽滅菌鍋構(gòu)造1、壓力表2、安全閥3、放氣閥4、軟管5、緊固螺栓6、滅菌桶7、篩架8、水手提式高壓蒸汽滅菌鍋7/23/202352微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1、加水至止水線；2、滅菌物品包裹好；3、開啟放氣閥；4、加熱排氣；5、達(dá)到預(yù)定表壓，開始計(jì)時(shí)；6、關(guān)閉熱源，當(dāng)壓力降至0.05MPa時(shí)，緩慢開啟放氣閥。高壓蒸汽滅菌鍋使用方法7/23/202353微生物學(xué)格式微生物的生長及控制4、過濾1、低溫冷藏法冷凍法2、輻射：紫外線、電離輻射和強(qiáng)可見光等3、干燥和滲透壓（高滲）其他物理控制方法7/23/202354微生物學(xué)格式微生物的生長及控制過濾除菌7/23/202355微生物學(xué)格式微生物的生長及控制（二）化學(xué)方法殺菌1.表面消毒劑(surfacedisinfactant)是指對一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)治療用的化學(xué)藥劑。7/23/202356微生物學(xué)格式微生物的生長及控制類型名稱及使用濃度作用機(jī)制應(yīng)用范圍醇類70-75%乙醇使膜損傷、蛋白質(zhì)變性皮膚、器械醛類0.5-10%甲醛破壞蛋白質(zhì)氫鍵或氨基物品消毒，接種箱、接種室的熏蒸酚類3-5%石炭酸蛋白質(zhì)變性，損傷細(xì)胞膜地面、家具、器皿表面活性劑類0.05-0.1%新潔而滅蛋白質(zhì)變性、破壞細(xì)胞膜皮膚、粘膜、手術(shù)器械染料2-4%龍膽紫與蛋白質(zhì)羧基結(jié)合皮膚、傷口氧化劑類0.1%高錳酸鉀氧化蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)皮膚、尿道3%雙氧水污染物件表面重金屬類2%紅汞與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合使失活皮膚、傷口0.1-0.5%硫酸銅植物病原菌酸堿類5-10%醋酸破壞細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)房間消毒常用表面消毒劑及應(yīng)用7/23/202357微生物學(xué)格式微生物的生長及控制影響消毒劑作用的因素消毒劑種類濃度作用時(shí)間細(xì)菌菌齡種類環(huán)境有機(jī)物溫度酸堿度7/23/202358微生物學(xué)格式微生物的生長及控制

是指那些能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇性毒性的化學(xué)藥劑；根據(jù)來源分為兩類：人工合成(主要是一些生長因子類似物)磺胺類藥物；微生物產(chǎn)生抗生素2、化學(xué)治療劑(chemotherapeutant)7/23/202359微生物學(xué)格式微生物的生長及控制（1）磺胺類藥物—生長因子類似物

是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的生長因子類似物藥物；也是人類第一個(gè)成功地用于特異性抑制某種微生物的生長來治療疾病的化學(xué)治療劑。7/23/202360微生物學(xué)格式微生物的生長及控制對氨基苯甲酸（PABA）(正常代謝物）磺胺(代謝物拮抗物）磺胺類藥物的殺菌機(jī)制—PABA代謝類似物7/23/202361微生物學(xué)格式微生物的生長及控制二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶四氫葉酸輔酶F核酸合成細(xì)菌體內(nèi)合成葉酸二氫蝶啶二氫蝶酸二氫蝶酸合成酶PABAGlu7/23/202362微生物學(xué)格式微生物的生長及控制二氫葉酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶四氫葉酸輔酶F核酸合成磺胺藥TMPTMP(三甲基芐二氨嘧啶)——磺胺增效劑細(xì)菌體內(nèi)葉酸合成受阻二氫蝶啶二氫蝶酸二氫蝶酸合成酶PABA假二氫葉酸7/23/202363微生物學(xué)格式微生物的生長及控制（2）抗生素(antibiotics)一類由微生物或其他生物生命活動(dòng)過程中合成的次生代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們在很低濃度時(shí)就能抑制或干擾他種生物（包括病原菌、病毒和癌細(xì)胞等)的生命活動(dòng)，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑；目前在臨床上應(yīng)用的抗生素僅五六十種。7/23/202364微生物學(xué)格式微生物的生長及控制抗生素的抗菌譜由于不同微生物對不同抗生素的敏感性不一樣，抗生素的作用對象就有一定的范圍，這種作用范圍成為抗生素的抗菌譜。7/23/202365微生物學(xué)格式微生物的生長及控制抗生素的作用機(jī)制抑制細(xì)胞壁合成；干擾細(xì)胞膜的功能；抑制蛋白質(zhì)的合成；抑制核酸的合成；7/23/202366微生物學(xué)格式微生物的生長及控制1.抑制細(xì)胞壁合成青霉素萬古霉素桿菌肽頭孢菌素環(huán)絲氨酸TMP磺胺藥PAPB細(xì)胞膜多粘菌素短桿菌肽鏈霉素卡那霉素四環(huán)素3.抑制蛋白質(zhì)合成紅霉素氯霉素2.抑制RNA合成2.抑制DNA解旋酶諾氟沙星新生霉素主要抗生素和化學(xué)治療劑的作用模型利福霉素利福平3.抑制蛋白質(zhì)合成4.干擾細(xì)胞膜合成