炭疽檢驗技術(shù)

炭疽檢驗技術(shù)第1頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

炭疽是由炭疽桿菌引起的人獸共患急性、熱性、敗血性傳染病。其病理變化的特點(diǎn)是脾臟顯著腫大，皮下及漿膜下結(jié)締組織出血浸潤，血液凝固不良，呈煤焦油樣。人感染后多表現(xiàn)為皮膚炭疽、肺炭疽及腸炭疽，偶有伴發(fā)敗血癥。炭疽（Anthrax）第2頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)病、死亡污染環(huán)境形成芽胞經(jīng)口食入食草動物通過直接接觸、消化道、呼吸道等途徑感染人類食肉動物偶爾感染

第3頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陽性；長而直的大桿菌，菌體兩端平直；大小為1.0～1.5um×3～5um，致病菌中最大的；無鞭毛，不能運(yùn)動。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）第4頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月莢膜染色在碳酸鹽培養(yǎng)基中、厭氧環(huán)境下生成莢膜。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）炭疽桿菌在病人、病畜體內(nèi)多散在或呈2～3個短鏈排列，有莢膜（紅色）第5頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月在活炭疽病畜體或死亡后未經(jīng)解剖的尸體內(nèi)，不形成芽胞。一旦體內(nèi)炭疽桿菌暴露于空氣中，接觸了游離氧，在一定溫度下(12--42℃)就會形成芽胞。芽胞呈卵圓形或圓形，位于菌體中央或稍偏向一端。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）第6頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月A：炭疽芽孢薄片（透射電鏡）有致密的胞膜

B：炭疽芽孢（掃描電鏡）收縮成橢圓形

C：炭疽繁殖體薄片（透射電鏡）第7頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

炭疽桿菌為兼性需氧菌，在12～44℃都能生長，最適生長溫度為37℃。最適pH為7.3～7.6。在普通瓊脂平皿培養(yǎng)基上生長成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，邊緣不整齊，能形成幾個或數(shù)十個菌體相連的長鏈，低倍顯微鏡觀察呈卷發(fā)狀。在血液瓊脂平皿培養(yǎng)基上，生長出濕潤粘稠的菌落，菌落周圍不溶血。二、培養(yǎng)特性第8頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月光鏡下炭疽桿菌菌落邊緣呈卷發(fā)狀第9頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月在血液瓊脂平皿培養(yǎng)基上不溶血或微溶血第10頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月三、致病性與免疫性致病物質(zhì):主要有二種莢膜:由質(zhì)粒編碼,具有抗吞噬作用炭疽毒素:由質(zhì)粒編碼（致死主要因素）保護(hù)性抗原（protectiveantigen，PA）水腫因子（edemafactor，EF）致死因子(lethalfactor，LF)第11頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月四、抵抗力芽胞抵抗力強(qiáng)煮沸40min或干熱140oC3h滅活；在干燥土壤或皮毛中能存活數(shù)年至20年；對化學(xué)消毒劑抵抗力強(qiáng)(5%石炭酸5d殺死）；對碘及氧化劑較敏感；繁殖體的抵抗力弱對青霉素、紅霉素、氯霉素敏感

第12頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月炭疽病原學(xué)檢查炭疽血清學(xué)檢查五、炭疽實(shí)驗室檢查第13頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月炭疽病原學(xué)檢查標(biāo)本采集和樣品處理細(xì)菌培養(yǎng)涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查Ascoli試驗動力檢查噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗串珠試驗生化試驗炭疽PCR基因檢測五、炭疽實(shí)驗室檢查第14頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月炭疽血清學(xué)檢查標(biāo)本采集和樣品處理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平檢測（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗ELISA）血清中抗炭疽莢膜抗體膠體金檢測五、炭疽實(shí)驗室檢查第15頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月《人間傳染的病原微生物名錄》序號病原菌名稱危害程度分類實(shí)驗活動所需生物安全實(shí)驗室級別學(xué)名中文名大量活菌操作動物感染實(shí)驗樣本檢測非感染性材料的實(shí)驗1Bacillusanthracis炭疽芽孢桿菌第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-12Brucellaspp布魯氏菌屬第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-13Burkholderiamallei

鼻疽伯克菌

第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-14Coxiellaburnetii

伯氏考克斯體

第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-1

大量活菌操作：實(shí)驗操作涉及“大量”病原菌的制備，或易產(chǎn)生氣溶膠的實(shí)驗操作（如病原菌離心、凍干等）。動物感染實(shí)驗：特指以活菌感染的動物實(shí)驗。

樣本檢測：包括樣本的病原菌分離純化、藥物敏感性實(shí)驗、生化鑒定、免疫學(xué)實(shí)驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動。非感染性材料的實(shí)驗：如不含致病性活菌材料的分子生物學(xué)、免疫學(xué)等實(shí)驗。第16頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月炭疽病原檢驗程序標(biāo)本處理（方法根據(jù)標(biāo)本情況選擇）直接涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查接種培養(yǎng)（可用選擇性培養(yǎng)基、血培養(yǎng)基）37℃，16~48hAscoli試驗基因檢測可疑菌落（形態(tài)）初檢培養(yǎng)性鑒定試驗深入鑒定涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查動力檢查液體培養(yǎng)噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗產(chǎn)莢膜培養(yǎng)及光鏡檢查串珠試驗生化試驗基因檢測酶免疫法測外毒素動物毒性測定第17頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月采取標(biāo)本時必須遵循的兩條原則1、盡可能的在抗生素治療前采取標(biāo)本；2、除必要時并在具備條件的實(shí)驗室內(nèi)，不得用解剖的方式獲取標(biāo)本，所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第18頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月1、血液標(biāo)本所有的疑似病例和病畜，都應(yīng)采取血液標(biāo)本5-10ml，標(biāo)本量至少應(yīng)滿足下列檢查的需要：涂片進(jìn)行顯微鏡檢查；接種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)；分離血清檢查抗體；常規(guī)血液檢查。熒光定量PCR檢測2、皮膚潰瘍標(biāo)本在皮膚炭疽病人潰瘍邊緣用棉拭子擦拭，沾取分泌物。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第19頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月3、糞便與嘔吐物標(biāo)本表現(xiàn)消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標(biāo)本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無菌的容器中。4、痰與咳碟標(biāo)本表現(xiàn)為呼吸道癥狀的可疑病人應(yīng)收集其痰液標(biāo)本，無痰液者，應(yīng)取供細(xì)菌分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，打開平皿蓋置病人口鼻10cm處；令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第20頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月5、腦脊液標(biāo)本表現(xiàn)為腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液。6、尸體標(biāo)本食草動物死于炭疽時，通常會從口、鼻、肛門等腔道開口流出血液，這種血液應(yīng)是首先采取的標(biāo)本。如果血液已滲入土壤，則應(yīng)收集混有血液的土壤作為標(biāo)本。沒有血液流出，或已不可能獲取血液標(biāo)本時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實(shí)質(zhì)性臟器獲得組織標(biāo)本。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第21頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月7、肉類標(biāo)本如果懷疑罹患炭疽的牲畜已被宰殺，或?qū)ι唐啡忸愡M(jìn)行常規(guī)檢查時，可剪取小塊肉類標(biāo)本。如有可能，特別應(yīng)剪取肝臟、脾臟等富含血以及含有淋巴組織的標(biāo)本。8、毛皮或其他可疑污染物品標(biāo)本剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無菌試管內(nèi)，加適量的無菌生理鹽水浸泡。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第22頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月9、水標(biāo)本檢查水體污染時，用廣口瓶收集水樣。10、土壤標(biāo)本在牲畜死亡或宰殺的地點(diǎn)，應(yīng)取土壤標(biāo)本以供檢查。一般要采集表層土壤（10cm內(nèi)），每份150g左右。（一）炭疽病原學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第23頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月所有來自病人、病畜、尸體的標(biāo)本都應(yīng)首先進(jìn)行直接涂片鏡檢。步驟：涂片、革蘭染色及莢膜染色、顯微鏡檢查鏡檢：取末稍血液或其他材料制成涂片后，染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有多量單在、成對或2～4個菌體相連的短鏈排列、竹節(jié)狀有莢膜的粗大桿菌，即可確診。（二）炭疽病原學(xué)檢查——顯微鏡檢查第24頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭染色（二）炭疽病原學(xué)檢查——顯微鏡檢查第25頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月莢膜染色（二）炭疽病原學(xué)檢查——顯微鏡檢查第26頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月采集到的標(biāo)本均應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板和選擇性平板。（三）炭疽病原學(xué)檢查——細(xì)菌分離培養(yǎng)第27頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)本處理：無菌的標(biāo)本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1ml，組織標(biāo)本應(yīng)先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以白金耳涂開。污染或陳舊的標(biāo)本，均應(yīng)首先制成懸液。根據(jù)標(biāo)本中含菌量的多少，可將懸液適當(dāng)稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再10000rpm離心1分鐘，取富集的沉淀物。將所得的懸液沸水浴15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1ml。（三）炭疽病原學(xué)檢查——細(xì)菌分離培養(yǎng)第28頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

以上的平皿在37℃孵育過夜或24小時后，觀察培養(yǎng)情況。粗糙不發(fā)光，比較扁平，有點(diǎn)兒象蠟樣桿菌的菌落但較小，卷發(fā)狀。有的菌體形態(tài)不規(guī)則，有彗星狀拖尾，白或灰白色。（三）炭疽病原學(xué)檢查——細(xì)菌分離培養(yǎng)第29頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月在血平皿上為白色菌落，較粘，不溶血或微溶血。（三）炭疽病原學(xué)檢查——細(xì)菌分離培養(yǎng)第30頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

在靜止液體培養(yǎng)基中生長在上層和底部，培養(yǎng)基透明，拿起則呈絲絮狀下垂，搖之均勻混濁，無菌膜和壁環(huán)。1、肉湯生長（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第31頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月診斷炭疽簡便而快速的方法，其優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)失效時，仍可用于診斷，因而適宜于腐敗病料及動物皮張或風(fēng)干、淹浸過肉品的檢驗。但此法缺乏高度特異性，因為炭疽桿菌耐熱抗原在其他腐生芽胞桿菌也共有。新鮮、陳舊和外環(huán)境標(biāo)本都可采樣20-50g，加水5-10倍，煮沸10分鐘，用雙層濾紙過濾后制成可溶性熱沉淀抗原，用于熱沉淀反應(yīng)（Ascoli試驗。2、Ascoli試驗（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第32頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

取一玻璃沉淀管（直徑2-4mm，高20-40mm），將0.3ml炭疽菌沉淀血清加于小玻璃管底部，再緩緩加入采集處理的可溶性熱沉淀抗原約0.3ml于血清上層，注意勿使液面混合。置37℃5min，于兩液面間出現(xiàn)白色沉淀環(huán)為陽性。本實(shí)驗應(yīng)有炭疽菌診斷抗原作陽性對照。炭疽菌沉淀血清處理的可溶性熱沉淀抗原白色沉淀環(huán)（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗2、Ascoli試驗第33頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

在蓋玻片周圍涂凡士林，將待檢菌的液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物用生理鹽水制成的均勻懸液滴于中央，再將凹玻片蓋于其上。迅速翻過來使蓋玻片在上，菌懸液懸成滴。置高倍鏡下觀察，細(xì)菌不應(yīng)有運(yùn)動。3、動力試驗（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第34頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月4、噬菌體裂解和青霉素敏感性將挑取的可疑菌落密集劃線接種于平板上，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴一診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8～24h后，在滴噬菌體處有透明噬菌體斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)，便宜可斷定接種物為炭疽芽胞桿菌。（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第35頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月4、噬菌體裂解和青霉素敏感性（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第36頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

制備有牛肉消化液瓊脂培養(yǎng)基的載玻片，涂種待檢菌，在一端加青霉素紙片或紙條。置平皿中于37℃培養(yǎng)4～6小時后，在低倍鏡下觀察。在有菌生長和抑菌區(qū)的臨界線處，應(yīng)有明顯典型串珠形態(tài)。5、串珠試驗串珠試驗時炭疽桿菌的形態(tài)：串珠狀或長鏈狀（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第37頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

葡萄糖麥芽糖蔗糖乳糖甘露醇水楊素MRVP石蕊牛乳+++—————產(chǎn)酸，液化遲緩產(chǎn)酸不產(chǎn)氣

不產(chǎn)生靛基質(zhì)和H2S6、生化試驗API50CH/E鑒定條可以進(jìn)行炭疽生化鑒定（四）炭疽病原學(xué)檢查——鑒定試驗第38頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

待測模板的制備：模板制備可直接從標(biāo)本樣品，也可從培養(yǎng)物制。標(biāo)本將炭疽桿菌接種于固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18h，取培養(yǎng)物懸浮于1ml生理鹽水，離心，棄上清，沉淀用ph7.8TE溶液洗起懸浮，于沸水浴中煮15min。離心，上清用0.22um的濾器除菌過濾。濾液即為模板，可置4℃?zhèn)溆糜赑CR擴(kuò)增。（五）炭疽病原學(xué)檢查——PCR鑒定試驗第39頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月cap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap外R：CGGATTGTATATGGAGTGGG產(chǎn)物大：1242bp

rpoB普1F：GTACGCCAATCGATATCATGrpoB普1R：GATCATCGTCATCTTCCGTA產(chǎn)物大?。?18bp

pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA普R:AGACCGTGACAATGATGGAA產(chǎn)物大小：923bp引物序列：（五）炭疽病原學(xué)檢查——PCR鑒定試驗第40頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

反應(yīng)體系(50μl)10×反應(yīng)緩沖液5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）4μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μl無菌去離子水37μlTaqDNA聚合酶1μl

反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃5min。（五）炭疽病原學(xué)檢查——PCR鑒定試驗第41頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)本采集和樣品處理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平檢測（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗ELISA）血清中抗炭疽莢膜抗體膠體金檢測炭疽血清學(xué)檢查第42頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)血清學(xué)檢驗的結(jié)果可以對病人做出追溯診斷，由于診斷必須由雙份血清做出，需要特別強(qiáng)調(diào)急性期血清的采取。首份血清應(yīng)在檢視病人時采取，通常應(yīng)一次采取血液標(biāo)本供涂片鏡檢，細(xì)菌分離培養(yǎng)，血清學(xué)檢查及常規(guī)的血液檢查使用。血清分離后置4℃保存，待獲得恢復(fù)期血清后，一同進(jìn)行抗體檢查。恢復(fù)期血清應(yīng)在發(fā)病后15日左右采取。（一）炭疽血清學(xué)檢查——標(biāo)本采集和樣品處理第43頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）炭疽血清學(xué)檢查——

抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA測定第44頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA測定程序包被抗原：所用各孔加入檢測用炭疽標(biāo)準(zhǔn)芽胞抗原液或檢測用炭疽毒素抗原液100μl，酶標(biāo)板貼上封口膜，置4℃過夜。次日，甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100μl，甩干，反復(fù)洗滌3次，每次3min。↓待檢血清反應(yīng)：每種待測血清使用兩行，以增加測定結(jié)果的可分析性。兩行的1~12孔各加生理氯化鈉溶液100μl。在第1孔加待測血清100μl，從第1孔以倍比稀釋法向后至第12孔進(jìn)行稀釋混勻。酶標(biāo)板貼上封口膜，置37℃60min。甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100μl，甩干，反復(fù)洗滌3次，每次3min。(同時做空白、正常血清孔對照)↓酶標(biāo)抗體反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊（兔）抗人