無菌工藝驗證培養(yǎng)基模擬灌裝試驗

無菌工藝驗證培養(yǎng)基模擬灌裝試驗國家大容量注射劑工程技術研究中心123|42

|Cont

tents培養(yǎng)基灌裝相關法規(guī)要求如何設計培養(yǎng)基灌裝方案

培養(yǎng)基灌裝的評價與調(diào)查常見問題及FDA

483缺陷

國家大容量注射劑工程技術研究中心3

|

無菌藥品基本理念無菌藥品的生產(chǎn)須滿足其質量和預定用途的要求，應最大限度降低微生物、各種微粒和熱原的污染。生產(chǎn)人員的技能、所接受的培訓及其工作態(tài)度是達到上述目標的關鍵因素無菌藥品的生產(chǎn)必須嚴格按照精心設計并經(jīng)驗證的方法及規(guī)程進行

|處理或成品檢驗。國家大容量注射劑工程技術研究中心空調(diào)系統(tǒng)資質職責公用設施人員操作生產(chǎn)設備環(huán)境監(jiān)控容器密封質量保證|

質量控制質量受權人

過程控制4

|無菌特性組成清潔消毒

質量保證更衣確認

人員衛(wèi)生

文件體系物料質量

無菌藥品風險分析為基礎國家大容量注射劑工程技術研究中心5

|

培養(yǎng)基模擬灌裝試驗培養(yǎng)基模擬灌裝試驗---使用培養(yǎng)基作為藥品的替代品（Placebo）進行無菌模擬生產(chǎn)，對無菌工藝進行驗證。

–

培養(yǎng)基灌裝在某種意義上是一種挑戰(zhàn)性試驗，因為幾乎在

所有情況下，微生物在培養(yǎng)基中的繁殖和生長要比在實際

產(chǎn)品中更容易全面反映整個生產(chǎn)過程采用無菌工藝生產(chǎn)無菌產(chǎn)品的能力。

|各國藥品法規(guī)要求的基本內(nèi)容。國家大容量注射劑工程技術研究中心6

|培養(yǎng)基模擬灌裝試驗

相關法規(guī)要求

|國家大容量注射劑工程技術研究中心7

||

ng

US

FDA和EU

GMP的要求

FDA

CGMP

無菌工藝藥品指南An

aseptic

processing

operatio

on

should

be

validated

using

a

microbiological

growth

mediu

um

in

place

of

the

product.

This

process

simulati

ion,

also

known

as

a

media

fill.

EU

GMP

Annex1

無菌藥品的生產(chǎn)Validation

of

aseptic

processin

should

include

a

process

simulation

test

using

a

nutrient

t

medium

(media

fill).國家大容量注射劑工程技術研究中心8

|

2010版GMP附錄一：無菌制劑第四十七條

無菌生產(chǎn)工藝的驗證應包括培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。

應根據(jù)產(chǎn)品的劑型以及培養(yǎng)基的選擇性、澄清度、濃度和滅菌的適用性選擇培養(yǎng)基。應盡可能模擬常規(guī)的無菌生產(chǎn)工藝，包括所有對產(chǎn)品的無菌特性有影響的關鍵操作，及生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的各種干預和最差條件。

培養(yǎng)基模擬灌

|

裝試驗的首次驗證，每班次應連續(xù)進行3次合格的試驗?？諝鈨艋到y(tǒng)、設備、生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應重復進行培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗通常應按生產(chǎn)工藝每班次半年進行1次，每次至少一批。國家大容量注射劑工程技術研究中心9

|

2010版GMP附錄一：無菌制劑

培養(yǎng)基灌裝容器的數(shù)量應足以保證評價的有效性。批量較小的產(chǎn)品，培養(yǎng)基灌裝的數(shù)量應至少等于產(chǎn)品的批量。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗的目標是零污染，應遵循以下要求：

（1）灌裝數(shù)量少于5000支時，不得檢出污染品；

（2）灌裝數(shù)量在5000至10000支時：

有1支污染，需調(diào)查，可考慮重復試驗；

有2支污染，需調(diào)查后，進行再驗證。

（3)

灌裝數(shù)量超過10000支時：

|

有1支污染，需調(diào)查；

有2支污染，需調(diào)查后，進行再驗證。

（4）發(fā)生任何微生物污染時，均應進行調(diào)查。國家大容量注射劑工程技術研究中心批量（瓶）3000允許染菌的數(shù)量（瓶）010

|

注冊申報要求SFDA

化學藥品注射劑基本技術要求（2008）

…

培養(yǎng)基灌裝驗證是對設備、環(huán)境以及人員操作的一種系統(tǒng)驗證,是判斷無菌保證水平的關鍵手段…工藝驗證工作主要為培養(yǎng)基灌裝驗證試驗。灌裝的批數(shù)、批量與合格標準見表1。

|4750

63007760≤1≤2≤3國家大容量注射劑工程技術研究中心fofo

|11

|

相關指南文件PDA

關于培養(yǎng)基模擬灌裝的技術報告

–

PDA

Technical

Repo

ort

No.

28,

Process

Simulation

Testing

or

Sterile

Bulk

Pharmaceutical

Chem

micals,

Revised

Supplement

2006

–

PDA

Technical

Repo

ort

No.22

1996,

Process

Simulation

Testing

or

Aseptically

Filled

Products

）國家大容量注射劑工程技術研究中心12

|培養(yǎng)基模擬灌裝試驗

試驗設計

|國家大容量注射劑工程技術研究中心13

|

1、試驗涵蓋范圍模擬必須包括產(chǎn)品成為無菌狀態(tài)后的所有的無菌生產(chǎn)工藝步驟(如轉運,

灌裝,

裝載/卸載,

凍干,

加塞,

軋蓋)

模擬必須包括所有的無菌處理(如灌裝線的設置,

無菌連接,人員的干擾操作)

培養(yǎng)基灌裝研究不包括非無菌混合操作或產(chǎn)品的除菌工藝(如無菌過濾)

培養(yǎng)基的制備和滅菌可以與產(chǎn)品的

|國家大容量注射劑工程技術研究中心14

|

2、多產(chǎn)品簡化試驗思路一條灌裝線生產(chǎn)多個產(chǎn)品時，

根據(jù)下列因素可被劃分為不同的類型組

灌裝工藝

不同的容器、密封方式由此選出兩個或更多個在下列方面能涵蓋所有其它相關產(chǎn)品的產(chǎn)品：

容器的大小、開放或密封的設計

灌裝線的速度和干預

|

凍干,

貯存容器的形式、轉移的方式推薦使用類似于矩陣式試驗設計，選擇產(chǎn)品和工藝國家大容量注射劑工程技術研究中心15

|

模擬灌裝實驗的設計包裝容器代表性選擇：

–

對于多規(guī)格、容器形狀不同的灌裝生產(chǎn)線，應對不同大

小、形狀的容器進行評估。

–

多數(shù)可能選用最大敞口直徑的容器和最低生產(chǎn)線速度；

–

有時也會選擇容易倒落的小型容器用來代表最差情況，

因可能需要更多的人工干預；

–

當不能兼顧

|

時，應考慮選取有代表性的幾種容器進行培

養(yǎng)基模擬灌裝試驗。國家大容量注射劑工程技術研究中心材質與安裝質量16

|

3、驗證與確認穩(wěn)定的產(chǎn)品質量性能確認及工藝驗證（PQ/PV）可靠的設備性能

運行確認（OQ）安裝確認（IQ）

|用戶需求與設計

設計確認（DQ）國家大容量注射劑工程技術研究中心17

|

驗證開始前的準備工作設備設施確認

HVAC及壓空系統(tǒng)（或氮氣）的確認

設備的在線清洗和滅菌CIP

P,SIP滅菌工藝驗證

濕熱、干熱滅菌工藝

除菌過濾驗證及空氣過濾器的完整性檢測

容器/膠塞密封完好性測試人員培訓

|

無菌更衣確認環(huán)境監(jiān)控符合要求國家大容量注射劑工程技術研究中心18

|

4、模擬灌裝實驗的設計最差狀況：高于或低于正常范圍的條件限度，與正常生產(chǎn)條件相比最有可能造成工藝或生產(chǎn)失敗的條件。宜盡可能模擬實際無菌生產(chǎn)過程，并包括產(chǎn)品加工中的“最差狀況”。其設計應具有以下幾方面的代表性：

–

時間代表性

|

–

運行代表性

–

包裝容器代表性國家大容量注射劑工程技術研究中心19

|

模擬灌裝實驗的設計時間代表性：

–

應選擇正常工作階段的不同的時間間隔，并考慮可能

的中斷、換班。培養(yǎng)基灌裝應持續(xù)足夠長的時間，覆

蓋允許的工藝時間限度，并包括實際加工中最常發(fā)生

的操作。操作代表性：

–

根據(jù)實際生產(chǎn)中可能發(fā)生的動作或操作來設計培養(yǎng)基

|

中發(fā)生的、允許和禁止的干預事件的一覽表，并在試

驗中進行模擬。國家大容量注射劑工程技術研究中心20

|

模擬灌裝實驗的設計運行代表性：應模擬包括“最差狀況”的生產(chǎn)條件下進行培養(yǎng)基灌裝。（如：最大干預次數(shù)、模擬的加卸料、可能的生產(chǎn)線停機的糾正、灌裝針/管的調(diào)整和更換、人工軋蓋、在線過濾器的更換以及所用人員的數(shù)量等）

|國家大容量注射劑工程技術研究中心|21

|

最差條件的設計（1）儲存時間的驗證灌裝設備、部件、儲罐、無菌物料、藥液在實際灌封前能夠放置的最長時間

–

1.

灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料需要再滅菌（除菌

）的時間間隔

?

用超出單項驗證后確定的最長保存時間的設備部件、儲

罐、無菌物料參與培養(yǎng)基灌裝試驗

–

2.

產(chǎn)品從無菌過濾到灌封加塞完成所需要的時間

?

無菌過濾后存放在中間儲罐內(nèi)的培養(yǎng)基模擬實際生產(chǎn)時產(chǎn)

品的最大儲存時間后再灌封產(chǎn)品在灌裝后密封前的儲存時間國家大容量注射劑工程技術研究中心22

|

最差條件的設計（2）最長灌裝的持續(xù)時間最保守的設計：在培養(yǎng)基灌封試驗中，模擬生產(chǎn)用時最長的批量所需要的時間，其中包括正常的干擾時間（換班、設備維修）。（一般不采用）其他的設計：1

1.在生產(chǎn)完成后接著進行培養(yǎng)基灌封實驗2.為了減少灌封瓶數(shù)，在每批試驗開始、中間及結束前均灌裝培養(yǎng)基，

|

–

任何干擾操作都應在培養(yǎng)基灌裝時進行

–

在正常生產(chǎn)過程中所需的最長時間，包括可能發(fā)生的事件，人員的

換班等國家大容量注射劑工程技術研究中心|擬一次23

|

最差條件的設計（3）干預的設計所有干預都應是預先設定和進行記錄正常的—每班次都會發(fā)生（灌封線裝配，稱量調(diào)節(jié)，加膠塞/鋁蓋，處理倒瓶，中控取樣，環(huán)境監(jiān)測，手工補充軋蓋等）非正常的—非正常情況才會發(fā)生（設備故障，灌封線堵塞，軌道調(diào)節(jié)，拆卸/替換破損的部件）SOP中應列出哪些干預是容許的，非正常的干預至少每年模干預的次數(shù)應該等于正常生產(chǎn)時發(fā)生的次數(shù)國家大容量注射劑工程技術研究中心|設備組裝加入膠塞取出卡住的膠塞取走倒下的玻瓶手工裝載到凍干機放置熱電偶環(huán)境監(jiān)測-放置和取走培養(yǎng)皿操作人員進出及更衣24

|干預舉例—冷凍干燥工藝不同區(qū)域玻瓶破碎設備故障更換灌裝針頭灌裝針頭位置調(diào)整自動稱量故障自動加塞故障國家大容量注射劑工程技術研究中心25

|

5、培養(yǎng)基灌裝試驗的頻率新建的或生產(chǎn)工藝、設備、人員等重大變更后的無菌工藝生產(chǎn)線，必須經(jīng)至少連續(xù)三批合格的培養(yǎng)基灌裝試驗常規(guī)生產(chǎn)條件下的再驗證頻率，培養(yǎng)基模擬試驗通常按生產(chǎn)工藝每班次半年進行1次，每次至少一批。生產(chǎn)線生產(chǎn)不同規(guī)格的無菌產(chǎn)品，則應考慮不同規(guī)格的產(chǎn)品的因素，培養(yǎng)基灌裝試驗的最差狀況進行評估。

|員，保證每年至少參加一次成功的培養(yǎng)基灌裝試驗。國家大容量注射劑工程技術研究中心26

|

變更后培養(yǎng)基模擬灌裝試驗變更及其評估

對產(chǎn)品或生產(chǎn)線的每一種變更，均應根據(jù)書面的變更控

制系統(tǒng)進行評估

。

如果通過評估認為此項變更會影響到無菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品

的無菌保證水平，則需要進行增補性培養(yǎng)基模擬灌裝實

驗。

比如，設施或設備的變化、生產(chǎn)線配置的變動、人員重

|

環(huán)境監(jiān)控異常和無菌檢查結果陽性等。國家大容量注射劑工程技術研究中心|培養(yǎng)溫度27

|

6、實驗用培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的選擇培養(yǎng)基選擇

適應廣譜微生物生長，包括細菌和真菌

較好的澄明度，較小的粘度

液體培養(yǎng)基易于除菌過濾

常用培養(yǎng)基：3％大豆胰蛋白肉湯（TSB）

厭氧培養(yǎng)基僅在特殊情況下使用（FTM）

干粉工藝：具備與干粉產(chǎn)品流動性能相似的無菌TSB干粉或

無菌安慰劑粉末（PEG,乳糖,甘露醇…)20-35℃，目標值±2.5℃，不少于14天；如選擇兩個溫度，

則每一溫度下至少培養(yǎng)7天，從低溫開始。國家大容量注射劑工程技術研究中心28

|

惰性替代粉末的選擇惰性替代品選擇要求：

–

無活性、易滅菌

–

易溶解

–

對培養(yǎng)基促進生長作用無副作用

–

易灌裝，流動性要好（培養(yǎng)基流動性較差）常用替代品

–

聚乙二醇Polyethylene

glycol

系列(PEG

6000,PEG

8000）,

甘露醇Mannitol，乳糖Lactose等

|

–

事先需要伽馬輻照滅菌（鈷60，用量約15～25kGy）

–

應進行無菌性、抑菌性和溶解度的測試國家大容量注射劑工程技術研究中心29

|

培養(yǎng)基的適應性檢查培養(yǎng)基適應性檢查

應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢

查培養(yǎng)基灌裝試驗前或同時進行。

必須用藥典要求的標準微生物或工廠特定微生物（分離

自環(huán)境人員監(jiān)測及無菌試驗）來進行

通常為枯草芽孢桿菌、白色念珠菌，菌液濃度控制約在

100個菌/ml

加入的菌液應小于100

CF

FU/單位

|

生長良好，判該培養(yǎng)基的適應性檢查符合規(guī)定國家大容量注射劑工程技術研究中心30

|

7、灌裝體積與數(shù)量單位灌裝體積

選擇的體積要使培養(yǎng)基能適當?shù)亟佑|容器內(nèi)表面，并且適當翻

轉或旋轉，接觸到密封件的內(nèi)表面。

每只容器的灌裝體積一般不少于總容積的1/3，但也要考慮保

留25

%

至40

%的頂空能確?？夏艽嬖诘奈⑸铽@得足夠的氧

氣生長。

對于厭氧灌裝:

用惰性氣體代替氧氣，

并使之完全充滿容器灌封試驗數(shù)量

綜合考慮統(tǒng)計學要求和實際生產(chǎn)批量。

|

5000瓶，則培養(yǎng)基灌封至少應為實際生產(chǎn)線的最大批次量。

PIC

(>3000瓶)：如果正常生產(chǎn)的批次量低于3000瓶，則培養(yǎng)

基灌封至少應為實際生產(chǎn)線的最大批次量。國家大容量注射劑工程技術研究中心|31

|

8、培養(yǎng)基模擬灌裝實驗的陽性對照培養(yǎng)基陽性對照實驗：

隨機選取已經(jīng)完成14天培養(yǎng)的灌裝培養(yǎng)基樣品，按照藥典要求

–

常用枯草芽孢桿菌、白色念珠球菌或工廠特定菌作為陽性菌

–

將每個菌種準備含<100cfu

u/0.1ml的菌液，每個菌種接種2支

培養(yǎng)基樣品，同時并平板計數(shù)（雙份）

–

對真菌在20-25°C下培養(yǎng)，對細菌在30-35

°C下培養(yǎng)，每天

檢查，5天內(nèi)需有生長跡象國家大容量注射劑工程技術研究中心I.32

|MP

9、培養(yǎng)基灌封實驗的合格標準FDA、EU

GMP

和中國新版GM

無菌附錄：灌封量<5000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調(diào)查，并重新驗

證(3批)。II.

灌封量為5000-10000瓶時，若有1瓶污染，視調(diào)查結果決定

是否需要重新進行1批培養(yǎng)基灌封試驗；若有兩瓶污染，必

須重新驗證（3批），同時進行徹底調(diào)查。III.

灌封量>10000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調(diào)查；若有兩瓶

|國家大容量注射劑工程技術研究中心污染瓶數(shù)01234595%置信限值333

|

培養(yǎng)基灌封實驗的合格標準PIC及SFDA研發(fā)注冊標準：在95

5%置信限時污染率低于0.1%。

計算公式：污染率

=

(95%置信限值)/(灌封容器數(shù))

×

100%

污染瓶數(shù)與95%置信限值間的關系678910

|4.74

6.3

7.75

9.15

10.

.51

11.84

13.15

14.43

15.7116.9

6國家大容量注射劑工程技術研究中心菌空氣破真空（不使用惰性氣體），全壓塞、軋蓋1.2.3.4.

1.

2.

3.34

|

10

0、舉例-凍干工藝方式A：模擬灌裝、裝載/卸載過程，縮短放置時間容器內(nèi)灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機凍干機內(nèi)部分抽真空，在室溫放置一定的時間，不進行冷凍。用無菌空氣破真空（不使用惰性氣體），全壓塞、軋蓋缺點:真空度不能過高，不能照成培養(yǎng)基沸騰。方式B：以經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基模擬凍干過程容器內(nèi)灌封好經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機模擬凍干過程，直到容器內(nèi)的培養(yǎng)基大致達到正常濃度。用無

|缺點：耗時長，需開發(fā)特殊的凍干程序，營養(yǎng)支持性不均一，影響微生物的存活力。

國家大容量注射劑工程技術研究中心1.2.35

|

凍干工藝方式C：模擬灌裝、裝載/卸載過程，縮短放置時間，不抽真空或補充空氣容器內(nèi)灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機凍干機不抽真空或者邊抽真空邊補充無菌空氣。在室溫放

置一定的時間，不進行冷凍。注意：用培養(yǎng)基完全模擬凍干工藝非常困難(

如時間長、真空、低溫等)

應該首先識別有污染風險的活動，并加以模擬(

如未完全密封小瓶

|

小瓶必須不被冷凍

注意確保培養(yǎng)基的需氧狀態(tài)國家大容量注射劑工程技術研究中心|注意事項36

|

舉例-無菌粉末分裝工藝方法A

在灌裝線上手工或增加灌裝設備，先灌裝液體培養(yǎng)基，再分裝無

菌替代品粉末后壓塞、軋蓋。方法B

在灌裝線上手工或增加灌裝設備，先分裝無菌替代品粉末，再灌

裝液體培養(yǎng)基后壓塞、軋蓋。方法C

先灌裝干粉培養(yǎng)基，再手工或增加設備加入注射用水所用惰性劑或干粉培養(yǎng)基需事先經(jīng)過輻射滅菌。常用替代品粉末有聚乙二醇、甘露醇、乳糖等。應對添加替代品的量和對培養(yǎng)基適應性的影響進行研究和評估。國家大容量注射劑工程技術研究中心|37

|

舉例-無菌原料藥原料藥生產(chǎn)工藝中常有結晶步驟，因結晶過程有相變產(chǎn)生，也使模擬過程存在困難?？捎靡环N液體介質模擬結晶過程，讓其流經(jīng)除菌過濾器和所有管路加到結晶罐中。若結晶過程有加晶種的操作，模擬過程中也應有這樣的操作，晶種也可用模擬介質代替。為使晶體粒度均勻，有些結晶過程需要降溫，在模擬過程中一般不應降溫，因在低溫下抑制微生物生長。離心、洗滌和干燥環(huán)節(jié)一般采用常溫，以免溫度對微生物的影響。國家大容量注射劑工程技術研究中心38

|

11、環(huán)境及人員監(jiān)測環(huán)境和人員監(jiān)測－按照相應的規(guī)程和方案進行，應涵蓋無菌工藝各工序，頻次數(shù)與正常生產(chǎn)一致。包括：

空氣粒子數(shù)

沉降菌

浮游菌

表面微生物

人員監(jiān)測

|國家大容量注射劑工程技術研究中心39

|

12、其他建議要點模擬灌裝全過程建議應進行錄像，便于事后調(diào)查分析和原因查找，也有利于員工培訓。如有可能，應有專人觀察和記錄操作人員的有意或無意的干預行為及時間。在試驗設計時，有時還要考慮人員狀態(tài)，如夜班人員的注意力往往不夠集中。培養(yǎng)基灌封后可以進行生產(chǎn)，但要等培養(yǎng)基灌封合格后產(chǎn)品才能放行

|樣品或按照托盤應進行編號，以便

于調(diào)查和追溯國家大容量注射劑工程技術研究中心40

|培養(yǎng)基模擬灌裝試驗

結果分析與調(diào)查

|國家大容量注射劑工程技術研究中心41

|

培養(yǎng)后檢查目檢培養(yǎng)基是否渾濁，是否有微生物生長要由經(jīng)過培訓、并且有資質能夠發(fā)覺微生物生長跡象的人員進行檢查如果在兩個溫度下培養(yǎng)時，必須在溫度切換時進行中間判讀可疑單位立即交給質量控制的微生物

人員，進行進

|一步分離培養(yǎng)和鑒定。根據(jù)染菌單位數(shù)，判斷是否達到驗

證接受標準國家大容量注射劑工程技術研究中心污染

率|42

|灌裝污染曲線圖

1

污染可能來源于液體培養(yǎng)基

(

如與培養(yǎng)基貯罐非無菌連接，

在循環(huán)管路中受到污染，微生

物持續(xù)繁殖)。在灌裝結束時，

應注意保持培養(yǎng)基貯罐處于無菌密閉狀態(tài)，在儲罐內(nèi)取樣測

試，可以核實這樣的假設。灌裝過程(時間或灌裝數(shù)量)國家大容量注射劑工程技術研究中心污染率|43

|灌裝污染曲線圖

2

表明污染僅發(fā)生在試驗初

期，可能污染來自起始的

生產(chǎn)設備中（

膠塞容器/

軌道,

計量泵

/

針頭)，在灌裝過程中污染被部分或

全部“清洗掉”。灌裝過程(時間或灌裝數(shù)量)國家大容量注射劑工程技術研究中心染率

污

|灌裝過程(時間或灌裝數(shù)量)44

|灌裝污染曲線圖

3

出現(xiàn)一個尖峰（在短時段的一

些產(chǎn)品被污染）可能與在灌裝

過程中不正確操作或干預導致

的污染有關。

很關鍵的是必須知道被污染產(chǎn)

品灌裝的準確時間，以及當時

實施的干預措施（灌裝操作過

程的錄像是非常有用的），這

樣會比較容易調(diào)查到原因。國家大容量注射劑工程技術研究中心率

污染灌裝過程(時間或灌裝數(shù)量)45

|

灌裝污染曲線圖

4

同樣可能是某個如果錯誤

的干預措施所造成的，不

同的是該污染影響到液體

的管路/回路時（如培養(yǎng)

基貯罐的變化，泵或針的|

替換），導致微生物持續(xù)

繁殖。國家大容量注射劑工程技術研究中心污染率

|灌裝過程(時間或灌裝數(shù)量)46

|灌裝污染曲線圖

5

非常不幸的是，這種現(xiàn)象

是最常出現(xiàn)的，也是最難

調(diào)查的。如果這種現(xiàn)象在

多次試驗中反復出現(xiàn)，可

能說明這個工藝存在不確

定因素，需要采取根本的

措施（如

更衣/著裝、消

毒劑和氣流模式的改變)國家大容量注射劑工程技術研究中心47

|

失敗調(diào)查流程|國家大容量注射劑工程技術研究中心

–

人員樣

–

表面樣

–

環(huán)境空氣樣2.

對培養(yǎng)基污染的評估

–

培養(yǎng)條件

–

對污染培養(yǎng)基的菌種必須進行

鑒定

–

確定培養(yǎng)基污|染可能發(fā)生的時

間3

3.

惰性粉末無菌測試的評估48

|

培養(yǎng)基灌裝失敗調(diào)查

11.

生產(chǎn)環(huán)境的監(jiān)控數(shù)據(jù)評估

4.

對氣體取樣結果的評估

–

壓縮空氣

–

氮氣等5.

對水的微生物的評估

–

純水

–

WFI6

6.

對培養(yǎng)基評估

–

培養(yǎng)基的配制和消毒記錄

–

培養(yǎng)基預培養(yǎng)的條件

–

培養(yǎng)基預培養(yǎng)的結果中國家大容量注射劑工程技術研究

48

心1.

粒子監(jiān)控評估–––––粒子測試監(jiān)控情況層流風速報警記錄煙霧測試歷史的監(jiān)控情況和趨勢2.

清潔和消毒評估

–

設備的清潔

|消毒3.

消毒劑的配制檢查

–

來源或配制比例記錄

–

效期及效力

49

|培養(yǎng)基灌裝失敗調(diào)查

24

4.

人員的評估–––––灌裝間最多的人數(shù)操作人員連續(xù)工作時間其它人員更衣情況手消毒及污染可能中

5

5.

干預操作的評估

–

頻次，是否有非預期干預

–

危險的程度

–

污染的樣品與干預的關聯(lián)國家大容量注射劑工程技術研究

49

心50

|

培養(yǎng)基灌裝失敗調(diào)查

3設備的評估

–

滅菌柜

?

滅菌裝載情況，滅菌程序和記錄等

?

最近的穿透試驗，泄漏試驗和干燥試驗的結果

–

隧道烘箱，洗瓶機等

?

運行狀態(tài)，參數(shù)是否正確

?

隧道烘箱各段層流壓差是否正確

–

灌裝設備的

|狀態(tài)

?

設備是否存在偏差和非計劃干預

–

過濾器完整性測試評估

?

產(chǎn)品和空氣過濾器完整性測試的結果中國家大容量注射劑工程技術研究

50

心51

|

培養(yǎng)基灌裝失敗后續(xù)措施調(diào)查結論與風險評估

培養(yǎng)基灌裝實驗結果有效

暫停生產(chǎn)，直至確定污染來源并采取有效的糾偏措施。

對培養(yǎng)基灌封實驗后和此前所生產(chǎn)的產(chǎn)品，進行風險評估

培養(yǎng)基灌裝實驗結果無效，重新進行培養(yǎng)基模擬灌裝

實驗

無菌灌裝區(qū)的物理條件不滿足要求

|后續(xù)措施

根據(jù)調(diào)查情況，采取糾偏措施后，進行一批或多批的培養(yǎng)

基模擬灌裝試驗。國家大容量注射劑工程技術研究中心52

|要點提示：

任何失敗的樣品都應單獨進行分離培養(yǎng)和鑒定，因為可能不只有一個污染源。

人員與環(huán)境等監(jiān)控的微生物也應進行分離鑒定，并與污染菌相比較。

避免試驗室引入新的污染，導致誤判

|國家大容量注射劑工程技術研究中心53

|培養(yǎng)基模擬灌裝試驗

常見問題及缺陷

|國家大容量注射劑工程技術研究中心|54

|

常見問題如何判斷哪些灌裝樣品不需要進行培養(yǎng)？

破損，影響到密封性的樣品

完整性測試（泄漏測試）失敗的樣品

文件中明確規(guī)定予以丟棄的中控測試樣品

設備自動剔除的樣品

文件中明確規(guī)定，每次干擾后應予手工剔除的樣品

（規(guī)定應詳細、明確，并需證明其可操作性和穩(wěn)定可

信性）。

剔除的樣品應進行記錄注明丟棄原因國家大容量注射劑工程技術研究中心55

|

常見問題是否需要厭氧工藝的模擬灌裝實驗？

如果工藝中存在沖氮氣等惰性氣體操作時

如果在環(huán)境監(jiān)測樣品或無菌試驗中檢出厭氧菌

有公司認為，即使常規(guī)無菌工藝，也應定期使用硫乙醇酸

鹽培養(yǎng)基進行厭氧工藝模擬實驗，或在模擬過程中進行培

養(yǎng)基的切換。培養(yǎng)基灌裝試驗中的樣品是否需要在培養(yǎng)過程中進行

|

不需要。培養(yǎng)基灌裝的樣品應在開始培養(yǎng)前進行操作，使

培養(yǎng)基充分接觸到內(nèi)部各個表面，開始培養(yǎng)后不應再進行

反轉等干擾。國家大容量注射劑工程技術研究中心56

|

常見問題如何對培養(yǎng)基灌裝試驗中的干預進行設計？

考慮到最差狀況

涵蓋整個生產(chǎn)周期，包括換班、連續(xù)生產(chǎn)等

所有干預應經(jīng)預先批準和文件化，干預描述、發(fā)生時間、頻

率、持續(xù)時間、受影響的瓶數(shù)等

常規(guī)干預每次培養(yǎng)基灌裝都要模擬，非常規(guī)干預可每年一次。培養(yǎng)基灌裝試驗是否要模擬所有生產(chǎn)過程？是否可以分段進行模擬試驗？

|

菌過濾以后。

可以，比如凍干工藝，可以把無菌灌裝和凍干模擬分開；粉

針工藝中可把加注培養(yǎng)基與粉劑分裝分開。但都需要有明確

方案和判斷標準。國家大容量注射劑工程技術研究中心|57

|

常見問題什么情況下，可以認為培養(yǎng)基灌裝試驗無效？

陽性對照失敗

工藝過程中在無菌操作區(qū)發(fā)生重大偏差，如停電，高效過

濾器損壞等在培養(yǎng)基灌裝試驗中，是否必須進行錄像？錄像的保存期需要多長？

不是必需的，錄像僅是一種可選的輔助調(diào)查和培訓手段。

如果采用了錄像措施，也僅作為公司內(nèi)部的資料（如同內(nèi)

部審計報告），不必向檢查員出示。

公司應有文件規(guī)定，什么情況下要進行錄像，錄像的儲存

時間等國家大容量注射劑工程技術研究中心58

|

Warning

LetterYour

firm

failed

to

design

and

perform

an

adequateaseptic

process

simulation

(i.e.,

media

fill)

basedupon

the

same

controls

used

for

routineproduction.

We

note

that

t

the

(b)(4)

wasobserved

(b)(4)

during

ac

ctual

production.

However,this

intervention

was

per

rformed

only

once

duringthe

media

fill

in

2009.

–

公司的培養(yǎng)

|

基灌裝驗證未根據(jù)日常生產(chǎn)的控制進行設計

和完成，如在實際生產(chǎn)中觀察到的一些干預操作國家大容量注射劑工程技術研究中心th59

|

Warning

LetterThe

written

procedur

res

related

to

theproduction

simulations

–

“media

fills”

-conducted

to

validate

e

your

capability

toaseptically

produce

s

small

volume

parenteral(SVP)

were

found

to

be

inadequate.

The

mediafills

for

this

line

did

not

represent

actualoperations

used

in

he

aseptic

production

ofampoules

and

vials.培養(yǎng)基灌

|裝沒有模擬實際的生產(chǎn)過程。國家大容量注射劑工程技術研究中心60

|

Warning

Letter-

A

routine

production

of

a

(b)(4)

Injection

vials

lot

would

take

approximately

(b)(4)

hours

to

be

filled.

Your

written

pro

ocedures

for

routine

production

require

tha

at

an

intervention

take

place

every

(b)(4)

minu

utes

for

fill-weight

verification

measurements.

SOP規(guī)定每幾分鐘就要對裝量進行測試，但是模擬

|國家大容量注射劑工程技術研究中心61

|

Warning

Letter–

The

process

simulatio

ons

(media

fill)

do

not

represent

actual

production

operations

for

your

sterile

API.

The

proces

ss

simulation

performed

by

your

firm

in

July

20

009

failed

to

include

simulation

of

the

routine

interventions

performed

in

a

typical

l

campaign

of

13

batches.

培養(yǎng)基灌裝驗證沒有反應實際無菌API的生產(chǎn)過程。

|

常干預的模擬。國家大容量注射劑工程技術研究中心|溶液。62

|

Warning

Letter–

Placebo

mediums

should

be

evaluated

for

their

ability

to

support

growth.

Their

placebo

used

in

the

process

simulation

is

sod

dium

phosphate

in

different

forms

(solution

and

anhy

ydrous)

and

sodium

chloride

solution.

培養(yǎng)基灌裝所用的介質，沒有評估其對微生物的抑菌

影響。培養(yǎng)基灌裝所用的材料是磷酸鈉和次氯酸鈉的國家大容量注射劑工程技術研究中心63

|

Warning

Letter–

Placebo

mediums

should

b

be

evaluated

for

their

inhibitory

effect

on

microor

rganisms.

Your

response

does

not

indicate

that

your

firm

uses

beta-lactamase

to

inhibit

the

effect

of

antib

biotic

residue

in

the

production

line

during

proc

cess

simulation.

沒有考慮可能存在的頭孢殘留對培養(yǎng)基中微生物的影響

|國家大容量注射劑工程技術研究中心|影響。64

|

Warning

Letter–

Gases

used

during

proc

cess

simulation

should

be

evaluated

for

their

inhib

bitory

effect

on

microorganisms.

Your

response

states

that

the

nitrogen

used

in

the

pro

ocess

simulation

is

removed

by

the

test

membrane

d

during

filtration.

沒有評估模擬過程中使用的氣體（氮氣）對微生物國家大容量注射劑工程技術研究中心65

|

Any

Ques

stions？

謝謝！

|Email

Address：gejunyou@126.com國家大容量注射劑工程技術研究中心安全閥基本知識如果壓力容器(設備/管線等)壓力超過設計壓力…1.盡可能避免超壓現(xiàn)象堵塞(BLOCKED)火災(FIRE)熱泄放(THERMALRELIEF)如何避免事故的發(fā)生?2.使用安全泄壓設施爆破片安全閥如何避免事故的發(fā)生?01安全閥的作用就是過壓保護!一切有過壓可能的設施都需要安全閥的保護!這里的壓力可以在200KG以上,也可以在1KG以下!設定壓力(setpressure)安全閥起跳壓力背壓(backpressure)安全閥出口壓力超壓(overpressure)表示安全閥開啟后至全開期間入口積聚的壓力.幾個壓力概念彈簧式先導式重力板式先導+重力板典型應用電站鍋爐典型應用長輸管線典型應用罐區(qū)安全閥的主要類型02不同類型安全閥的優(yōu)缺點結構簡單,可靠性高適用范圍廣價格經(jīng)濟對介質不過分挑剔彈簧式安全閥的優(yōu)點預漏--由于閥座密封力隨介質壓力的升高而降低,所以會有預漏現(xiàn)象--在未達到安全閥設定點前,就有少量介質泄出.100%SEATINGFORCE75502505075100%SETPRESSURE彈簧式安全閥的缺點過大的入口壓力降會造成閥門的頻跳,縮短閥門使用壽命.ChatterDiscGuideDiscHolderNozzle彈簧式安全閥的缺點彈簧式安全閥的缺點=10090807060500102030405010%OVERPRESSURE%BUILT-UPBACKPRESSURE%RATEDCAPACITY普通產(chǎn)品平衡背壓能力差.在普通產(chǎn)品基礎上加裝波紋管,使其平衡背壓的能力有所增強.能夠使閥芯內(nèi)件與高溫/腐蝕性介質相隔離.平衡波紋管彈簧式安全閥的優(yōu)點優(yōu)異的閥座密封性能,閥座密封力隨介質操作壓力的升高而升高,可使系統(tǒng)在較高運行壓力下高效能地工作.ResilientSeatP1P1P2先導式安全閥的優(yōu)點平衡背壓能力優(yōu)秀有突開型/調(diào)節(jié)型兩種動作特性可遠傳取壓先導式安全閥的優(yōu)點對介質比較挑剃,不適用于較臟/較粘稠的介質,此類介質會堵塞引壓管及導閥內(nèi)腔.成本較高.先導式安全閥的缺點重力板式產(chǎn)品的優(yōu)點目前低壓儲罐呼吸閥/緊急泄放閥的主力產(chǎn)品.結構簡單.價格經(jīng)濟.重力板式產(chǎn)品的缺點不可現(xiàn)場調(diào)節(jié)設定值.閥座密封性差,并有較嚴重的預漏.受背壓影響大.需要很高的超壓以達到全開.不適用于深冷/粘稠工況.幾個常用規(guī)范ASMEsectionI-動力鍋爐(FiredVessel)ASMEsectionVIII-非受火容器(UnfiredVessel)API2000-低壓安全閥設計(LowpressurePRV)API520-火災工況計算與選型(FireSizing)API526-閥門尺寸(ValveDimension)API527-閥座密封(SeatTightness)介質狀態(tài)(氣/液/氣液雙相).氣態(tài)介質的分子量&Cp/Cv值.液態(tài)介質的比重/黏度.安全閥泄放量要求.設定壓力.背壓.泄放溫度安全閥不以連接尺寸作為選型報價依據(jù)!如何提供高質量的詢價?彈簧安全閥的結構彈簧安全閥起跳曲線彈簧安全閥結構彈簧安全閥結構導壓管活塞密封活塞導向不平衡移動副(活塞)導管導閥彈性閥座P1P1P2先導式安全閥結構先導式安全閥的工作原理頻跳安全閥的頻跳是一種閥門高頻反復開啟關閉的現(xiàn)象。安全閥頻跳時，一般來說密封面只打開其全啟高度的幾分只一或十幾分之一，然后迅速回座并再次起跳。頻跳時，閥瓣和噴嘴的密封面不斷高頻撞擊會造成密封面的嚴重損傷。如果頻跳現(xiàn)象進一步加劇還有可能造成閥體內(nèi)部其他部分甚至系統(tǒng)的損傷。安全閥工作不正常的因素頻跳后果1、導向平面由于反復高頻磨擦造成表面劃傷或局部材料疲勞實效。2、密封面由于高頻碰撞造成損傷。3、由于高頻振顫造成彈簧實效。4、由頻跳所帶來的閥門及管道振顫可能會破壞焊接材料和系統(tǒng)上其他設備。5、由于安全閥在頻跳時無法達到需要的排放量，系統(tǒng)壓力有可能繼續(xù)升壓并超過最大允許工作壓力。安全閥工作不正常的因素A、系統(tǒng)壓力在通過閥門與系統(tǒng)之間的連接管時壓力下降超過3%。當閥門處于關閉狀態(tài)時，閥門入口處的壓力是相對穩(wěn)定的。閥門入口壓力與系統(tǒng)壓力相同。當系統(tǒng)壓力達到安全閥的起跳壓力時，閥門迅速打開并開始泄壓。但是由于閥門與系統(tǒng)之間的連接管設計不當，造成連接管內(nèi)局部壓力下降過快超過3%，是閥門入口處壓力迅速下降到回座壓力而導致閥門關閉。因此安全閥開啟后沒有達到完全排放，系統(tǒng)壓力仍然很高，所以閥門會再次起跳并重復上述過程，既發(fā)生頻跳。導致頻跳的原因導致接管壓降高于3%的原因1、閥門與系統(tǒng)間的連接管內(nèi)徑小于閥門入口管內(nèi)徑。2、存在嚴重的渦流現(xiàn)象。3、連接管過長而且沒有作相應的補償（使用內(nèi)徑較大的管道）。4、連接管過于復雜（拐彎過多甚至在該管上開口用作它途。在一般情況下安全閥入口處不允許安裝其他閥門。）導致頻跳的原因B、閥門的調(diào)節(jié)環(huán)位置設置不當。安全閥擁有噴嘴環(huán)和導向環(huán)。這兩個環(huán)的位置直接影響安全閥的起跳和回座過程。如果噴嘴環(huán)的位置過低或導向環(huán)的位置過高，則閥門起跳后介質的作用力無法在閥瓣座和調(diào)節(jié)環(huán)所構成的空間內(nèi)產(chǎn)生足夠的托舉力使閥門保持排放狀態(tài)，從而導致閥門迅速回座。但是系統(tǒng)壓力仍然保持較高水平，因此回座后閥門會很快再次起跳。導致頻跳的原因C、安全閥的額定排量遠遠大于所需排量。

由于所選的安全閥的喉徑面積遠遠大于所需，安全閥排放時過大的排量導致壓力容器內(nèi)局部壓力下降過快，而系統(tǒng)本身的超壓狀態(tài)沒有得到緩解，使安全閥不得不再次起跳頻跳的原因閥門拒跳：當系統(tǒng)壓力達到安全閥的起跳壓力時，閥門不起跳的現(xiàn)象。安全閥工作不正常的因素1、閥門整定壓力過高。2、閥門內(nèi)落入大量雜質從而使閥辦座和導套間卡死或摩擦力過大。3、彈簧之間夾入雜物使彈簧無法被正常壓縮。4、閥門安裝不當，使閥門垂直度超過極限范圍（正負兩度）從而使閥桿組件在起跳過程中受阻。5、排氣管道沒有被可靠支撐或由于管道受熱膨脹移位從而對閥體產(chǎn)生扭轉力，導致閥體內(nèi)機構發(fā)生偏心而卡死。安全閥拒跳的原因閥門不回座或回座比過大：安全閥正常起跳后長時間無法回座，閥門保持排放狀態(tài)的現(xiàn)象。安全閥工作不正常的因素1、閥門上下調(diào)整環(huán)的位置設置不當。2、排氣管道設計不當造成排氣不暢，由于排氣管道過小、拐彎過多或被堵塞，使排放的蒸汽無法迅速排出而在排氣管和閥體內(nèi)積累，這時背壓會作用在閥門內(nèi)部機構上并產(chǎn)生抑制閥門關閉的趨勢。3、閥門內(nèi)落入大量雜質從而使閥瓣座和導套之間卡死后摩擦力過大。安全閥不回座或回座比過大的因素：4、彈簧之間夾入雜物從而使彈簧被正常壓縮后無法恢復。5、由于對閥門排放時的排放反力計算不足，從而在排放時閥體受力扭曲損壞內(nèi)部零件導致卡死。6、閥桿螺母（位于閥桿頂端）的定位銷脫落。在閥門排放時由于振動使該螺母下滑使閥桿組件回落受阻。安全閥不回座或回座比過大的因素：7、由于彈簧壓緊螺栓的鎖緊螺母松脫，在閥門排放時由于振動時彈簧壓緊螺栓松動上滑導致閥門的設定起跳值不斷減小。

8、閥門安裝不當，使閥門垂直度超過極限范圍（正負兩度）從而使閥桿組件在回落過程中受阻。

9、閥門的密封面中有雜質，造成閥門無法正常關閉。

10、鎖緊螺母沒有鎖緊，由于管道震動下環(huán)向上運動，上平面高于密封面，閥門回座時無法密封安全閥不回座或回座比過大的因素：謝謝觀看癌基因與抑癌基因oncogene&tumorsuppressorgene24135基因突變概述.癌基因和抗癌基因的概念.癌基因的分類.癌基因產(chǎn)物的作用.癌基因激活的機理主要內(nèi)容疾病：

——是人體某一層面或各層面形態(tài)和功能（包括其物質基礎——代謝）的異常，歸根結底是某些特定蛋白質結構或功能的變異，而這些蛋白質又是細胞核中相應基因借助細胞受體和細胞中信號轉導分子接收信號后作出應答（表達）的產(chǎn)物。TranscriptionTranslationReplicationDNARNAProtein中心法規(guī)Whatisgene?基因：

—是遺傳信息的載體

—是一段特定的DNA序列（片段）

—是編碼RNA或蛋白質的一段DNA片段

—是由編碼序列和調(diào)控序列組成的一段DNA片段基因主宰生物體的命運：微效基因的變異——生物體對生存環(huán)境的敏感度變化關鍵關鍵基因的變異——生物體疾病——死亡所以才有：“人類所有疾病均可視為基因病”之說注：如果外傷如燒傷、骨折等也算疾病的話，外傷應該無法歸入基因病的行列。Genopathy問：兩個不相干的人，如果他們患得同一疾病，致病基因是否相同？再問：同卵雙生的孿生兄弟，他們患病的機會是否一樣，命運是否相同？┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

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┷┷┷┷┯┯┯┯┯

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ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷增添缺失替換DNA分子(復制)中發(fā)生堿基對的______、______

和

，而引起的

的改變。替換增添缺失基因結構基因變異的概念：英語句子中的一個字母的改變，可能導致句子的意思發(fā)生怎樣的變化？可能導致句子的意思不變、變化不大或完全改變THECATSATONTHEMATTHECATSITONTHEMATTHEHATSATONTHEMATTHECATONTHEMAT同理：替換、增添、缺失堿基對，可能會使性狀不變、變化不大或完全改變。基因的結構改變,一定會引起性狀的改變??原句：1.基因多態(tài)性與致病突變基因變異與疾病的關系2.單基因病、多基因病3.疾病易感基因

基因多態(tài)性polymorphism是指DNA序列在群體中的變異性（差異性）在人群中的發(fā)生概率>1%（SNP&CNP)<1%的變異概率叫做突變基因多態(tài)性特定的基因多態(tài)性與疾病相關時，可用致病突變加以描述SNP:散在單個堿基的不同，單個堿基的缺失、插入和置換。

CNP:DNA片段拷貝數(shù)變異，包括缺失、插入和重復等。同義突變、錯義突變、無義突變、移碼突變

致病突變生殖細胞基因突變將突變的遺傳信息傳給下一代(代代相傳),即遺傳性疾病。體細胞基因突變局部形成突變細胞群（腫瘤）。受精卵分裂基因突變的原因物理因素化學因素生物因素基因突變的原因（誘發(fā)因素）紫外線、輻射等堿基類似物5BU/疊氮胸苷等病毒和某些細菌等自發(fā)突變DNA復制過程中堿基配對出現(xiàn)誤差。UV使相鄰的胸腺嘧啶產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體,DNA復制時二聚體對應鏈空缺，堿基隨機添補發(fā)生突變。胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶胸腺嘧啶紫外線誘變物理誘變(physicalinduction)

5溴尿嘧啶(5BU)與T類似，多為酮式構型。間期細胞用酮式5BU處理，5BU能插入DNA取代T與A配對；插入DNA后異構成烯醇式5BU與G配對。兩次DNA復制后,使A/T轉換成G/C，發(fā)生堿基轉換,產(chǎn)生基因突變?；瘜W誘變(chemicalinduction)堿基類似物(baseanalogues)誘變AT5-BUA5-BUAAT5-BU5-BU(烯醇式)

(酮式)GGC1.生物變異的根本來源，為生物進化提供了最初的原始材料,能使生物的性狀出現(xiàn)差別，以適應不同的外界環(huán)境，是生物進化的重要因素之一。2.致病突變是導致人類遺傳病的病變基礎?；蛲蛔兊囊饬x概述：腫瘤細胞惡性增殖特性（一）腫瘤細胞失去了生長調(diào)節(jié)的反饋抑制正常細胞受損,一旦恢復原狀，細胞就會停止增殖，但是腫瘤細胞不受這一反饋機制抑制。（二）腫瘤細胞失去了細胞分裂的接觸抑制。正常細胞體外培養(yǎng)，相鄰細胞相接觸，長在一起，細胞就會停止增殖，而腫瘤細胞生長滿培養(yǎng)皿后，細胞可以重疊起生長。（三）腫瘤細胞表現(xiàn)出比正常細胞更低的營養(yǎng)要求。（四）腫瘤細胞生長有一種自分泌作用，自己分泌生長需要的生長因子和調(diào)控信號,促進自身的惡性增殖。Whatisoncogene?癌基因——是基因組內(nèi)正常存在的基因，其編碼產(chǎn)物通常作為正調(diào)控信號，促進細胞的增殖和生長。癌基因的突變或表達異常是細胞惡性轉化（癌變）的重要原因。——凡是能編碼生長因子、生長因子受體、細胞內(nèi)信號轉導分子以及與生長有關的轉錄調(diào)節(jié)因子等的基因。如何發(fā)現(xiàn)癌基因的呢?11910年，洛克菲勒研究院一個年輕的研究員Rous發(fā)現(xiàn)，雞肉瘤細胞裂解物在通過除菌濾器以后，注射到正常雞體內(nèi)，可以引起肉瘤，首次提出雞肉瘤可能是由病毒引起的。0.2m孔徑細菌過不去但病毒可以通過從病毒癌基因到細胞原癌基因的研究歷程：Roussarcomavirus,RSVthefirstcancer-causingretrovirus1958年，Stewart和Eddy分離出一種病毒，注射到小鼠體內(nèi)可以引起肝臟、腎臟、乳腺、胸腺、腎上腺等多種組織器官的腫瘤，因而把這種病毒稱為多瘤病毒。50年代末、60年代初，癌病毒研究成了一個極具想像力的研究領域，主流科學家開始進入癌病毒研究領域polyomavirus這期間，Temin發(fā)現(xiàn)RSV有不同亞型，且引起細胞惡變程度不同，推測RNA病毒將其遺傳信息傳遞給了正常細胞的DNA。這與Crick提出的中心法則是相違背的讓事實屈從于理論還是堅持基于實驗的結果？VSTemin發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶，1975年獲諾貝爾獎TeminCrickTemin的實驗設計：實驗設計簡單而巧妙：將合成DNA所需的“原料”，即A、T、C、G四種脫氧核苷酸，與破壞了外殼的RSV一起在體外40℃的條件下溫育一段時間結果在試管里獲得了一種新合成的大分子，它不能被RNA酶破壞，但卻可以被DNA酶所分解，證明這種新合成的大分子是DNA用RNA酶預先破壞RSV的RNA，再重復上述的試驗，則不能獲得這種大分子，說明這個DNA大分子是以RSV的RNA為模板合成的1969年，一個日本學者里子水谷來到Temin的實驗室，這是一個非常擅長實驗的年輕科學家。按Temin的設想，他們開始尋找RSV中存在“逆轉錄酶”的證據(jù)DNA

RNA

ProteinTranscriptionTranslationReplicationReplicationRe-Transcription修正中心法規(guī)據(jù)說，1975年Temin因發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶而獲諾貝爾獎時，Bishop懊惱不已，因為早在1969年他就認為Temin的RNADNA的“前病毒理論”有可能是正確的，并且也進行了一些實驗，但不久由于資深同事的規(guī)勸而放棄了這方面的努力。但Bishop馬上意識到：逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)為逆轉錄病毒致癌的研究提供了一條新途徑。一個RSV，三個諾貝爾獎?。?！1989年，UCSF的Bishop和Varmus根據(jù)逆轉錄病毒的復制機制發(fā)現(xiàn)了細胞癌基因，并獲諾貝爾獎。Cellularoncogene啟示：Perutz說:“科學創(chuàng)造如同藝術創(chuàng)造一樣，都不可能通過精心組織而產(chǎn)生”Bishop說:“許多人引以為豪的是一天工作16小時，工作安排要以分秒計……可是工作狂是思考的大敵，而思考則是科學發(fā)現(xiàn)的關鍵”Perutzsharedthe1962NobelPrizeforChemistrywithJohnKendrew,fortheirstudiesofthestructuresofhemoglobinandglobularproteins科學的本質和藝術一樣，都需要直覺和想像力請給自己一些思考的時間吧！癌基因的分類目前對癌基因尚無統(tǒng)一分類的方法，一般有下面3種分類方法：一、按結構特點分（6）類（一）src癌基因家族（二）ras癌基因家族（三）sis癌基因家族（四）myc癌基因家族（五）myb癌基因家族（六）其它：如fos，erb－A等。三、按細胞增殖調(diào)控蛋白特性分成（4）類（一）生長因子（二）受體類（三）細胞內(nèi)信號轉換器（四）細胞核因子二、按產(chǎn)物功能分（8）類（一）生長因子類（二）酪氨酸蛋白激酶（三）膜相關G蛋白（四）受體，無蛋白激酶活性（五）胞質絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（六）胞質調(diào)控因子（七）核反式調(diào)控因子（八）其它:db1、bcl－2癌基因產(chǎn)物參與信號轉導

胞外信號作用于膜表面受體→胞內(nèi)信使物質的生成便意味著胞外信號跨膜傳遞的完成。胞內(nèi)信使至少有：cAMP（環(huán)磷酸腺苷）IP3（三磷酸肌醇）PG（前列腺素）cGMP（環(huán)磷酸鳥苷）DG（二酰基甘油）Ca2＋（鈣離子）CAM（鈣調(diào)素）主要機制是通過蛋白激酶活化引起底物蛋白一連串磷酸化的生物信號反應過程,跨膜機制涉及到：（一）質膜上cAMP信使系統(tǒng)（二）質膜上肌醇脂質系統(tǒng)這兩個系統(tǒng)都是由受體鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白（GTP-regulatoryprotein，G蛋白）和效應酶（腺苷酸環(huán)化酶磷脂酶等）組成，有相似的信號轉導過程：即受體活化后引起GTP與不同G蛋白結合活化和抑制效應酶從而影響胞內(nèi)信使產(chǎn)生而發(fā)生不同的調(diào)控效應。（三）受體操縱的離子通道系統(tǒng)（四）受體酪氨酸蛋白激酶的轉導

（一）獲得性基因病

(acquiredgeneticdisease)例如：病毒感染激活原癌基因癌基因活化的機制

（二）染色體易位和重排使無活性的原癌基因轉位至強啟動子或增強子附近而被活化。與基因脆性位點相關。（三）基因擴增（四）點突變?nèi)┗虻漠a(chǎn)物與功能（一）癌基因產(chǎn)物作用的一般特點1.目前發(fā)現(xiàn)c-onc均為結構基因.2.癌基因產(chǎn)物可分布在膜質核也可分泌至胞外.（二）癌基因產(chǎn)物分類1.細胞外生長因子：TGF-b2.跨膜生長因子受體:MAPK3.細胞內(nèi)信號轉導分子:Gprotein/Ras4.核內(nèi)轉錄因子

（三）癌基因產(chǎn)物的協(xié)同作用實驗證明，用ras或myc分別轉染細胞，可使細胞長期增殖，但不能轉化成癌細胞，在裸鼠體內(nèi)也不能形成腫瘤。但用ras+myc同時轉染細胞，則使細胞轉化成癌細胞。說明：致癌至少需要2種或以上的onc協(xié)同作用，2種onc在2條通路上發(fā)揮作用，由于細胞增殖調(diào)控是多因子，多階段影響的結果。而影響增殖分化的onc達幾十種之多，所以大多數(shù)人認為：癌發(fā)生是多階段多步驟的。Whatistumorsuppressorgene?腫瘤抑制基因（抗癌基因、抑癌基因）——是調(diào)節(jié)細胞正常生長和增殖的基因。當這些基因不能表達，或其產(chǎn)物失去活性時，細胞就會異常生長和增殖，最終導致細胞癌變。反之，若導入或激活它則可抑制細胞的惡性表型?！┗蚺c抑癌基因相互制約，維持細胞增殖正負調(diào)節(jié)信號的相對穩(wěn)定。影響1歲的兒童“二次打擊”學說兩個等位基因同時突變視網(wǎng)膜母細胞瘤（Retinoblastoma）RB基因變異(13號染色體)

(1)脫磷酸化Rb蛋白（活性）與轉錄因子E2F結合，抑制基因的轉錄活性(2)磷酸化Rb蛋白（失活）與E2F解離，釋放E2F(3)E2F啟動基因轉錄(4)細胞進入增生階段(G1S)因此，Rb蛋白在控制細胞生長方面發(fā)揮重要作用一旦Rb基因突變可使細胞進入過度增生狀態(tài)RB基因的功能等位基因(allele)例如：花顏色基因位于一對同源染色體的同一位置上、控制相對性狀的兩個的基因叫等位基因(allele)一對相同的等位基因稱純合等位基因

一對不同的等位基因稱雜合等位基因

顯性基因隱性基因完全顯性不完全顯性共顯性問：女性的兩條X染色體基因應如何表達？拓展知識：X染色體基因中，有65%完全處于“休眠”狀態(tài)，20%僅在部分女性身上“休眠”，15%則完全逃離“休眠”狀態(tài)一旦其中一條X染色體被損壞，還可以由另一條X染色體來糾正男性卻只有一條X染色體，一旦它遭到破壞，男性就會患上血友病、色盲以及肌肉萎縮癥等各種遺傳病以前人們一直認為，在女性的兩條X染色體中，有一條染色體是完全不起作用或是處于“休眠”狀態(tài)的在Y染色體中，目前仍在“工作”的基因只剩下不到100個X染色體中“工作”的基因>1000個有一個這樣的故事：20年前一次意外事故，三個工人遭受鈷60（Co60)放射性核素的照射結果：一名工人不久死亡一名工人幾年后死于白血病最后一名工人20年后患糖尿病就診你知道醫(yī)生在為病人檢查時發(fā)現(xiàn)了什么嗎？鎖骨骨折肋骨串珠樣X光片發(fā)現(xiàn)廣泛性骨質缺損骨髓檢查——漿細胞比例為30%左右（正常為0.6-1.3%）(多發(fā)性骨髓瘤）因此，多基因病涉及遺傳因素和環(huán)境因素物理因素化學因素生物因素自發(fā)因素2.多基因病(polygenicdisease)：性狀或疾病的遺傳方式取決于兩個以上微效基因的累加作用，同時還受環(huán)境因素的影響，因此這類性狀也稱為復雜性狀或復雜疾?。╟omplexdisease）也叫：“復雜性狀疾病”近視(myopia)高血壓(hypertension)糖尿病(diabetes)精神分裂癥(schizophrenia)哮喘(asthma)腫瘤或癌

(tumororcancer)多基因病的遺傳要點數(shù)量性狀的遺傳基礎是兩對以上基因。這些基因之間沒有顯,隱性的區(qū)別,而是共顯性。每個基因對表型的影響很小,稱為微效基因。微效基因具有累加效應,即一個基因對表型作用很小,但若干個基因共同作用,可對表型產(chǎn)生明顯影響。不僅遺傳因素起作用,環(huán)境因素具有明顯作用。例如：結腸癌（Coloncancer)相關基因：NGX6，SOX7，ITGB1，HSPA9B，MAPK8，PAG，

RANGAP1，SRC和CDC2等。相關信號通路：ras/MEK/ERK，JNK，Rb/E2F，PI3K/AKT及受體相互作用相關通路，免疫反應相關通路以及細胞黏附相關通路等。①早期原發(fā)癌生長②腫瘤血管形成③腫瘤細胞脫落并侵入基質④進入脈管系統(tǒng)⑤癌栓形成⑥繼發(fā)組織器官定位生長⑦轉移癌繼續(xù)擴散例如：糖尿病(diabetes)依賴胰島素型糖尿病在位于第6號染色體上可能包含至少一個對I型糖尿病敏感的基因在人類基因組中，大約10個位點現(xiàn)在被發(fā)現(xiàn)似乎對I型糖尿病敏感其中：1)11號染色體位點IDDM2上的基因

2)葡萄糖激酶基因高血壓(hypertension)目前最受關注的是ATP2B1基因編碼一種膜蛋白，具有鈣泵特性能將高濃度細胞內(nèi)鈣泵出細胞外。精神神經(jīng)性疾病精神分裂癥基因表達改變/誘導增強家族史家暴基因本質：基因組變異驚嚇—？—基因突變——精神病多基因病的遺傳：易患性(liability)易感性(susceptibility)發(fā)病閾值(threshold)易患性(liability)——在多基因病發(fā)生中，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用決定一個個體患某種遺傳病的可能性。possibility遺傳因素(hereditaryfactors)環(huán)境因素(environmentalfactor)易感性(susceptibility)——特指由遺傳因素決定的患病風險，僅代表個體所含有的遺傳因素，易感性完全由基因決定。——在一定的環(huán)境條件下，易感性高低可代表易患性高低。riskwithdisease發(fā)病閾值(threshold)——當一個個體易患性高到一定限度就可能發(fā)病——這種由易患性所導致的多基因病發(fā)病最低限度稱為發(fā)病閾值minimum例如：三核苷酸拷貝數(shù)變異CGG(精氨酸)重復：——重復5-54次，正常——重復6-230次，攜帶者（敏感體質）——重復230-4000次，發(fā)病

如：脆性X染色體綜合征智力低下患者細胞在缺乏胸腺嘧啶或葉酸的環(huán)境中培養(yǎng)時往往出現(xiàn)