第十三章酶與生物催化劑課件

酶學(xué)研究簡史公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。一百余年前，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞生命活動的結(jié)果。1878年，Kuhne首次提出Enzyme一詞。1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。1926年，Sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)rRNA前體也具有酶的催化活性，提出“核酶ribozyme”

的概念。

酶在機(jī)體中十分溫和條件下的高效率催化作用，使得生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝有條不紊地進(jìn)行，并在多種因素的影響下對代謝發(fā)揮著巧妙的調(diào)節(jié)作用(實驗室中復(fù)雜有機(jī)物的合成與分解必須在高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等劇烈條件下才能進(jìn)行)。酶的生物學(xué)意義一、酶的分子組成蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor)

金屬離子小分子有機(jī)化合物全酶(holoenzyme)結(jié)合酶(conjugatedenzyme)單純酶(simpleenzyme)*各部分在催化反應(yīng)中的作用酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。

金屬激活酶(metal-activatedenzyme)金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。金屬離子的作用穩(wěn)定酶的構(gòu)象；參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。小分子有機(jī)化合物的作用在反應(yīng)中起運(yùn)載體的作用，傳遞電子、質(zhì)子或其它基團(tuán)。輔助因子分類（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度）

輔酶

(coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。

輔基

(prostheticgroup):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去?；蚍Q活性部位(activesite)，指必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。酶的活性中心(activecenter)活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)(bindinggroup)與底物相結(jié)合催化基團(tuán)(catalyticgroup)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。活性中心外的必需基團(tuán)常見基團(tuán)：His殘基的咪唑基、Ser殘基的羥基、Cys殘基的巰基及Glu殘基的γ-羧基。底物活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心第一節(jié)酶的催化機(jī)制一般酸堿催化酶分子的某些功能基團(tuán)起酸或堿催化作用，即供質(zhì)子（酸）或接納質(zhì)子（堿），從而促進(jìn)作用物發(fā)生過度態(tài)的轉(zhuǎn)變，加速反應(yīng)過程。一般酸堿催化作用通過酶催化中心的功能基團(tuán)形成酸性或堿性環(huán)境，影響底物的解離狀態(tài)而起作用，與無機(jī)酸堿的催化原理一樣。酸堿催化作用親核或親電催化酶分子的功能基團(tuán)或輔基呈正或負(fù)解離狀態(tài)，從而起親電攻擊（正解離）或親核擊（負(fù)解離）作用。金屬離子、輔基或輔酶可呈不同的解離狀態(tài)，直接參與催化作用。臨近效應(yīng)及定向排列酶對作用物的親和力導(dǎo)致作用物濃集到酶分子的表面上，從而提高了局部的反應(yīng)濃度。作用物與酶的結(jié)合具有定向作用，有利于作用物被催化攻擊，提高反應(yīng)效率。作用物與酶的結(jié)合胰凝乳蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)1）臨近效應(yīng)2）定向作用誘導(dǎo)契合作用酶與作用物的接觸，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的相互變形、相互適應(yīng)的變化。例如酶分子的構(gòu)象在作用物的誘導(dǎo)下發(fā)生改變，從而有利于酶與作用物的結(jié)合和促進(jìn)作用物過度狀態(tài)的形成。誘導(dǎo)契合作用5、綜合效應(yīng)酶的催化作用常常包括幾種催化機(jī)制。例如溶菌酶、糜蛋白酶的催化作用，包括一般酸堿催化、定向作用、親核攻擊等作用。1）溶菌酶：由129個氨基酸殘基組成，通過水解細(xì)菌壁多糖的b-糖苷鍵而達(dá)到殺菌作用。溶菌酶的催化反應(yīng)溶菌酶與多糖的結(jié)合溶菌酶的一般酸堿催化機(jī)制溶菌酶的催化特點溶菌酶只能水解NAM-NAG（N-乙?；迟|(zhì)酸-乙酰氨基葡萄糖）糖苷鍵，但不能水解NAG-NAM糖苷鍵。溶菌酶的結(jié)合部位正好結(jié)合六個糖環(huán)結(jié)構(gòu)，兩者形成多點的次級鍵結(jié)合。多糖與溶菌酶結(jié)合時發(fā)生誘導(dǎo)契合，水解點的糖環(huán)結(jié)構(gòu)由穩(wěn)定的椅式變成不穩(wěn)定的船式（過度狀態(tài)）。溶菌酶的水解點位于6糖環(huán)結(jié)構(gòu)的第4與第5位之間的NAM-NAGb-糖苷鍵。溶菌酶作用的最佳pH為5，此時各功能基團(tuán)處于最佳的不同解離狀態(tài)。2）糜蛋白酶：糜蛋白酶原（含245個氨基酸殘基）由胰腺分泌，受胰蛋白酶激活，在小腸催化蛋白質(zhì)水解。糜蛋白酶催化水解疏水性側(cè)鏈氨基酸（如芳香族氨基酸、亮基酸等）形成的肽鍵。具有一個疏水性口袋，結(jié)合氨基酸殘基的疏水性側(cè)鏈，決定其催化特異性。催化部位有Ser195、His57、Asp102組成一個電子接力系統(tǒng)，起催化作用。催化作用包括親核攻擊和酸堿催化，并形成不穩(wěn)定的四面體過度態(tài)。糜蛋白酶的催化特點糜

蛋

白

酶

的

催

化

機(jī)

制肽鍵電子接力糜

蛋

白

酶

的

催

化

機(jī)

制親核攻擊糜

蛋

白

酶

的

催

化

機(jī)

制糜

蛋

白

酶

的

催

化

機(jī)

制糜

蛋

白

酶

的

催

化

機(jī)

制第二節(jié)金屬在酶催化中的作用金屬酶與金屬激活酶由金屬離子作為輔基或輔酶與酶蛋白組成的酶稱為金屬酶（Metalloenzyme）。如碳酸酐酶（含鋅）和淀粉酶（含鈣）等。不含金屬離子，但需要金屬離子激活的酶稱為金屬激活酶。如檸檬酸合成酶（需鉀）和精氨酸酶（需錳）等。常見的幾種金屬酶金屬酶 所含金屬金屬酶 所含金屬羧肽酶A Zn 碳酸酐酶 Zn醇脫氫酶 Zn 堿性磷酸酶Zn鐵氧還蛋白Fe 脯氨酸羥化酶Fe順烏頭酸酶Fe 過氧化氫酶Fe賴氨酰氧化酶Cu 酪氨酸酶 Cu丁酰CoA脫氫酶Cu 尿酸酶 Cu脲酶 Ni 錳超氧化物歧化酶Mn谷胱甘肽過氧化物酶Se 淀粉酶 Ca常見的幾種金屬激活酶金屬激活酶 所需金屬金屬激活酶 所需金屬半乳糖苷酶 Na 檸檬酸合成酶K丙酮酸激酶 K,Mg 蛋白激酶Mg,Mn一般激酶 Mg,Mn 磷酸激酶 Mg精氨酸酶 Mn 丙酮酸脫羧酶 Mn烯醇化酶 Mn 丙酮酸羧化酶Mn,Zn磷脂酶A2Ca 磷脂酶CCa金屬在金屬酶中的作用參與催化反應(yīng):如碳酸酐酶、羧肽酶、嗜熱菌蛋白酶、醛縮酶，去除Zn后不影響酶的結(jié)構(gòu)，但使酶喪失催化活性。維持酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性：如Zn可連接B枯草桿菌淀粉酶形成二聚體，但不影響酶的活性。對酶活性起調(diào)節(jié)作用：如Zn可激活牛晶體亮氨酸氨肽酶，但對豬腎亮氨酸氨肽酶有抑制作用。非催化作用：如馬和人的醇脫氫酶含有Zn，但Zn既不起催化作用也不起維持酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性作用（其真實作用不明）。金屬酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系大多數(shù)金屬參與酶的催化作用，并存在于酶的活性部位或附近，可與酶蛋白和底物聯(lián)結(jié)成酶-金屬-底物三元絡(luò)合物。Zn的催化機(jī)制有三種：Zn-羰作用：作用物取代與Zn結(jié)合的水分子而直接與Zn結(jié)合，Zn起Lewis酸的作用，使結(jié)合的作用物極化而容易進(jìn)行親核攻擊。如醛縮酶和肽酶的催化作用。Zn-羥作用：作用物通過結(jié)合在Zn上的水分子而起作用。與Zn結(jié)合的OH-離子對作用物進(jìn)行攻擊，Zn起活化親核物質(zhì)的作用。如碳酸酐酶的催化作用。上述兩者的綜合作用：即作用物可直接與Zn結(jié)合但不取代結(jié)合在Zn上的水分子。Zn既極化作用物，又使水分子活化為親核離子。如碳酸酐酶的催化作用。羧基肽酶的催化作用碳酸酐酶的活性部位碳酸酐酶的催化作用第三節(jié)別構(gòu)酶一、基本概念別構(gòu)酶：調(diào)節(jié)分子（效應(yīng)物）與酶的調(diào)節(jié)亞基或調(diào)節(jié)部位結(jié)合時，使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶的催化活性改變，這類酶稱為別構(gòu)酶。協(xié)同效應(yīng)：當(dāng)作用物或效應(yīng)物與酶結(jié)合后促進(jìn)后續(xù)的作用物與酶結(jié)合，稱為正協(xié)同效應(yīng)；若是抑制后續(xù)的作用物與酶結(jié)合，稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。二、別構(gòu)酶的特征1、異促別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特征A）酶分子上存在與作用物結(jié)合并催化反應(yīng)的部位（催化中心）和與效應(yīng)物結(jié)合并調(diào)節(jié)活性的部位（調(diào)節(jié)中心）；B）催化中心和調(diào)節(jié)中心可以位于相同或不同的亞基上（催化亞基、調(diào)節(jié)亞基）；C）效應(yīng)物的作用可以是別構(gòu)激活或別構(gòu)抑制。2、同促別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特征A）酶分子上存在多個催化中心，催化中心之間可相互作用而影響酶的活性（沒有專門的調(diào)節(jié)中心，催化中心亦是調(diào)節(jié)中心）；B）作用物也是效應(yīng)物。作用物與酶結(jié)合后影響后續(xù)作用物與酶的結(jié)合，即協(xié)同效應(yīng)；C）作用物可以是正協(xié)同效應(yīng)或負(fù)協(xié)同效應(yīng)。血紅蛋白的同促別構(gòu)效應(yīng)三、別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制1）MWC模式（由Monod，Wyman，Changeux在1965年提出）A）別構(gòu)酶是一個寡聚體，亞基在酶分子中排列對稱。每一亞基對特定的配體都有結(jié)合部位，而且這些結(jié)合部位都相等。B）亞基具有不同的構(gòu)象狀態(tài)，稱R態(tài)和T態(tài)，前者的活性比后者高。C）當(dāng)一個亞基由T變成R態(tài)時，其他亞基也同時變?yōu)镽態(tài)（稱“齊變模式”）。而且酶的TR互變時，其對稱性保持不變（稱“對稱模式”）。D）T與R處于動態(tài)平衡之中，取決于別構(gòu)激活劑或作用物的濃度與別構(gòu)抑制劑的比值。2）KNF模式（由Koshland，Nemethy，F(xiàn)ilmer在1966年提出）A）別構(gòu)酶是由相同亞基構(gòu)成的寡聚體，但每個亞基都可以有不同的構(gòu)象狀態(tài)，即R或T態(tài)。前者的活性比后者高。B）R態(tài)和T態(tài)可共存于一個寡聚體中。當(dāng)作用物或效應(yīng)物與一個亞基結(jié)合后可引起該亞基構(gòu)象變化，這種變化再促使相鄰亞基的構(gòu)象變化從而改變后者對作用物的親和力。這種變化依順序進(jìn)行，直到所有亞基都發(fā)生同樣變化（稱“序變模式”）C）一個亞基與作用物或效應(yīng)物結(jié)合后，可引起相鄰亞基對后續(xù)作用物的親和力增加或降低。第四節(jié)核酶一、核酶（Ribozyme）簡介概念：核酶是具有催化活性的RNA，又稱為催化性RNA。核酶的概念由Zaug等人于1986年提出。核酶的特點：具有催化活性，如核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸二酯酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、RNA限制性內(nèi)切酶活性。反應(yīng)具有專一性。對競爭性抑制劑敏感。核酶的分類：1）按作用方式分類：剪切型：又分為兩類，一類剪切反應(yīng)發(fā)生在RNA前體的成熟過程中，另一類剪切反應(yīng)發(fā)生在某些動植物小環(huán)狀病原體RNA的復(fù)制過程中。剪接型：剪接反應(yīng)包括剪切反應(yīng)和連接反應(yīng)，如內(nèi)含子的切除和外顯子的連接。2）按作用物分類：自體催化：包括RNA的自我剪切和自我剪接反應(yīng)。異體催化：其作用物可以是RNA、多糖、DNA、氨基酸酯等。3）按結(jié)構(gòu)與來源分類：如錘頭型、發(fā)夾型、人丁型肝炎病毒、脈孢菌VS核酶。核酶的結(jié)構(gòu)包括一、二、三級結(jié)構(gòu)幾種核酶的二級結(jié)構(gòu)核酶的二、三級結(jié)構(gòu)RibozymetRNAPhe錘頭型核酶Theribosomeisaribozyme5.核酶催化作用機(jī)制反應(yīng)包括切斷舊的磷酸酯鍵(剪切反應(yīng))和形成新的磷酸酯鍵(剪接反應(yīng))。剪切反應(yīng)：由2’羥基氧親核攻擊臨近