冰凍切片的免疫熒光

免疫熒光通用操作規(guī)程冰凍切片的免疫熒光1, 動物組織直接OCT30%4C過夜后，OCT包埋。-20C3月，-80C長期保存。請勿保存于液氮。2, 冰凍切片機(jī)切片至少10um空氣枯燥2分鐘后-20C儲存3， 切片-20取出后，在通風(fēng)櫥放10-30分鐘以去除水汽，4%PFA15分鐘，或-20C152小時4, 1XPBS3X5min從今請保持玻片潮濕5, 有時,抗原修復(fù)3小時會得到更好的結(jié)果。為此請：選用穩(wěn)定的抗原修復(fù)方式〔真空負(fù)壓?微波修復(fù)?高壓修復(fù)?隔水加熱?電爐加熱〕…〔〕,抗原修復(fù)液必需遵循自然降溫規(guī)律,使用足量的抗原修復(fù)液…選擇不同PH值的修復(fù)液〔APH6.0B液EDTA-Na緩沖液PH8.0,6, 1小時

C液枸鹽酸緩沖液PH4.5〕5%BSA+10%in1xPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清inIxPBS〔無需封閉的蛋白7,4C過夜請用封閉液稀釋一抗8,其次天Wash,1XPBS,2x1min9, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔dyelight〕in封閉液，避光室1小時10, Wash,1XPBS,3x5min11, DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬滅劑封片，〔避開氣泡〕避光置于通風(fēng)櫥過夜4C保存石蠟切片的免疫熒光石蠟切片的免疫熒光1，--包埋〔見隨后操作步驟包塊2,2um,免疫熒光染色切片厚度至少

〕，制成石蠟6um,切片復(fù)水：切片復(fù)水：58°C20min-xylene2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-,DDW5min4,Rinse1xPBS,從今請保持玻片潮濕5，抗原修復(fù)過夜。為此請：選用穩(wěn)定的抗原修復(fù)方式〔真空負(fù)壓.微波修復(fù)?高壓修復(fù)?隔水加熱?電爐加熱〕…關(guān)注修復(fù)的溫度，時間〔抗原修復(fù)時在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時間〕，抗原修復(fù)液必需遵循自然降溫規(guī)律，使用足量的抗原修復(fù)液…選擇不同PH〔A液枸鹽酸緩沖液PH6.0BEDTA-NaPH8.0CPH4.5〕6， 室溫封閉1小時封閉液：5%BSA+10%inIxPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清inIxPBS〔細(xì)胞因子，無需封閉的蛋白7, 一抗4C 過夜請用封閉液稀釋一抗，假設(shè)沒有二抗種屬來源的正常血清細(xì)胞1%BSA封閉，同時肯定要有一個陰性比照。8, Wash,1XPBS,2x1min9, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔Dyelight〕in封閉液，避光室1小時10, Wash,1XPBS,3x5min11,DDWRinse,DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬滅劑封片，〔避開氣泡〕避光置于通風(fēng)櫥過夜14,干片后C 保存A:盡量選擇不同種屬來源的一抗：可同時染B:假設(shè)種屬來源一樣的一抗：可順次染色，抗原修復(fù):O/N第一個一抗：4C0/N,其次天對應(yīng)二抗@RT1hr短暫地封閉其次個一抗：@RT2hr,對應(yīng)二抗@RT1hrDAPI封片A:陰性比照：組織免疫熒光必做:排解非特異性染色不同樣本：承受確定不含一抗對應(yīng)抗原的標(biāo)本驗(yàn)證熒光信號的特異性B:陽性比照：承受確定含有一抗對應(yīng)抗原的標(biāo)本TUNEL與免疫熒光共染時細(xì)胞的免疫熒光1,80%融合,倒掉細(xì)胞培育液2, Rinse,用固定劑rinse—到兩次3, 4%15min,0.2%TritonX-100打孔5-10min；或者選用不同的固定方式：甲醇〔分析純orHPLC〕-20C10min丙酮〔HPLC〕-20C10min4%多聚甲醛+0.2%TritonX-10010min4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min細(xì)胞核核膜4%15min+-20C5min4%15min+-20C5min/微管蛋白4%10min@RT+4C10min+-20C1min4, Wash,1xPBS,2x1min從今請保持細(xì)胞潮濕5, 1小時封閉液：5%BSA+10%inIxPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清inIxPBS6, 一抗4C 過夜請用封閉液稀釋一抗7, Wash,1XPBS,2x1min8, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔Dyelight〕in封閉液，避光室1小