根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制培訓課件

根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制1.相關概念1.1根瘤菌(Rhizobia)：是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，它可以侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)。2根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制1.2根瘤菌的分類：表1根瘤菌分類系統(tǒng)Table1FredRhizobiumclassificationsystem種名

寄主植物的屬名苜蓿根瘤菌(R.meliloti)

菖蓿屬(Medicago)

胡蘆巴屬(Trigonella)三葉草根瘤(R.trifolii)車軸草屬(Tri如lium)豌豆根瘤菌(R.leguminasarum)

豌豆屬(Pisum)野豌豆屬(Vicia)

香豌豆屬(Lathyrus)兵豆屬(Lens)菜豆根瘤菌(R.phasoli)

菜豆屬(Phaseolus)羽扇豆根瘤菌(R.lupini)

羽扇豆屬(Lupinus)1932年，Fred等人首次提出了根瘤茵分類系統(tǒng)，他們根據互接種族的關系，將全部根瘤菌定義為1屬5種。

根瘤菌的早期分類一直是以互接種族(cross-in-oculationgroup)為主要依據的。3根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

Jordan在1984年出版的《伯杰系統(tǒng)細菌學手冊》(第一卷)中，總結了前人數值分類、DNA堿基組成、DNA同源性、血清血分析、胞外多糖成份分析、全細胞可溶性蛋白電泳和rRNA-DNA雜交等大量研究結果，對根瘤菌科分類系統(tǒng)進行了修訂。4根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制隨著原核生物分類技術的改進和根瘤菌研究工作的深入，對根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育的研究也隨著根瘤菌分類系統(tǒng)的不斷補充與完善而得以系統(tǒng)化、科學化。其后又發(fā)現了許多新種，并確定了其分類地位，目前，根瘤菌科已發(fā)展到7屬36種。5根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制1.3共生關系(Symbiosis)：

根瘤菌與相應的豆科植物及少數非豆科植物根系共生形成根瘤，能將空氣中的分子態(tài)氮還原為植物可利用的氨，對自然界的氮素循環(huán)起著十分重要的作用，豆科植物為根瘤菌提供生長繁殖所需的能量和營養(yǎng)物質。根瘤菌感染豆科植物形成根瘤共生體，是由根瘤菌和寄主植物2方面的遺傳因素所決定，根瘤菌具備實現固氮功能的全部遺傳因子，寄主植物提供固氮作用所需的條件。

指一個以上的有機體，雙方建立互利共存或一方有利對方無害地生活在一起的一種關系，生物之間共生關系有利于共生體對外界自然環(huán)境的生存適應。6根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制2.參與共生固氮的物質基礎

從生物化學和分子生物學角度來看，豆科植物一根瘤茵的相互識別屬親和性(陰性)識別系統(tǒng)，吸附的專化性取決于分子識別，參與分子識別的物質包括豆科植物凝集素(lectin)、類黃酮和根瘤菌表面多糖，并將它們分別稱為植物識別子(cognor)與細菌識別子(cognon)。分子識別即植物識別子與細菌識別子間結構互補的特異結合。7根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制2.1豆科植物凝集素作為媒介聯結菌體和根毛細胞；對糖殘基結合的特異性使吸附具有?；?；與細菌的cognon結構互補、相互聯結。

豆科植物的凝集素是其分泌的一種糖蛋白，它在吸附中有3種功能：8根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制2.2類黃酮類黃酮屬于植物次生物質，不直接參與豆科植物—根瘤菌分子識別反應。已有研究證實類黃酮能專一地誘導nod基因的表達，從而刺激NodRm因子的產生。

TonVanBrussel等認為nod基因的誘導物是nod基因本身，并發(fā)現豌豆根瘤菌胞外多糖能誘導8種新的誘導nod基因表達的類黃酮產生，這種受根瘤菌誘導而新合成的類黃酮又通過誘導nod基因的表達而控制根瘤菌表面多糖的產生，這樣識別信號不斷放大。9根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制2.3根瘤菌表面多糖根瘤菌表面具有與凝集素有特異結合能力的多糖，包括胞外多糖、莢膜多糖和脂多糖：EPS是根瘤菌分泌到細胞之外的多糖，CPS存在于根瘤菌的莢膜中，LPS是細胞壁成分。

EPS或CPS本身是一種可以與相應植物凝集素特異結合的半抗原，而LPS作為cognon時必須是完全型的，即含O一抗原；O一抗原中的糖組分有細菌種的特異性，使LPS在作為cognon起作用時表現出?；浴ander等(1978)從豌豆根瘤菌和寄主共生的相互作用中，證實了豌豆根瘤菌莢膜多糖和胞外多糖的重要性，他們指出豌豆根瘤菌的突變株由于不能合成正常量的胞外多糖，以致不能使豌豆植物結瘤。

根瘤菌的cognon依互作體系的不同而不同，是3種多糖中的1、2或3種，它們調節(jié)不同類型的吸附，并非同時參與作用。10根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制3.與共生固氮相關的基因3.1與共生固氮有關的根瘤菌基因

在豆科植物－根瘤菌共生固氮體系中，參與根瘤發(fā)育的根瘤菌基因可分為3類：第1類是結瘤基因(nod,nol,noe)；第2類是與細菌細胞表面結構有關的基因(exs,lps,ndv)；第3類是固氮基因(nif,fix)。結瘤基因

主要功能是共生關系早期過程中信號分子的形成與交換。它們位于根瘤菌的共生質粒(symplasmid)上，包括3組：調節(jié)基因(nodD)，共同結瘤基因(nodABCIJ)和宿主專一性基因（又叫基因hsn），如nodH。11根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制①調節(jié)基因nodD

存在于所有根瘤菌中，一般是組成型表達。其產物可激活其它nod基因的表達，但它的激活又受到宿主植物專一的黃酮類物質的調節(jié)。原因是，nod蛋白在類黃酮的存在下能夠和nodD基因啟動子中的30~60bp長的高度保守的核苷酸序列，即nodbox結合。所以一般認為，nodD是一轉錄結合物，調節(jié)其它nod基因的表達。②共同結瘤基因nodABCIJ

存在于所有根瘤菌中，具有較高同源性，并且在功能上是互補的，它對豆科植物根毛卷曲和皮層細胞分裂是必須的。③宿主專一性基因

控制根瘤菌的宿主范圍。目前，已克隆的結瘤基因約有50多個。12根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

根瘤菌的結瘤基因表達后，將合成并分泌一類脂寡糖化合物，即結瘤因子，作為根瘤菌返還給宿主植物的信號分子。與根瘤菌細胞表面結構有關的基因

研究表明，所有根瘤菌分泌的結瘤因子都具有相似的骨架結構：一個由3~5個N－乙酰氨基葡糖組成的糖骨架和在還原糖末端C2上連的一條脂肪酸鏈構成。但不同根瘤菌來源的結瘤因子在側鏈上羥基的取代基團、脂肪酰鏈的長度和不飽和方面表現出較大的差異，而這些結構的差異是與根瘤菌的宿主范圍緊密相關的。

與根瘤菌細胞表面結構有關的基因，即與胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)和中性葡聚糖合成有關的基因，分別稱exs,lps和ndv基因。它們對建立共生固氮關系是很重要的，這類基因突變，導致不能形成侵入線或形成空瘤。13根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制固氮基因

固氮基因可分為固氮酶基因（nif基因）和共生固氮基因（fix基因）。

nif基因是固氮微生物所共有的，有高度的保守性，它與肺炎克氏桿菌(K.Pneumonic)有同源性的固氮酶結構或調節(jié)基因。其中，nifA是轉錄調節(jié)基因，它對其它nif基因和某些基因進行正調控；nifDH是固氮酶的結構基因；nifL是負調節(jié)基因。fix基因是只在根瘤菌中發(fā)現的、控制共生固氮作用的基因，其中fixABC在電子傳遞中可能具有作用；已報導fixC對膜嵌入有一個信號序列；fixLJ對nifA基因轉錄調節(jié)。14根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制4.共生固氮過程

豆科植物－根瘤菌相互識別屬親和性(陰性)識別系統(tǒng)，它們之間相互作用形成根瘤的過程可分為5個階段：（1）根瘤菌趨化性地接近根毛細胞，并在植物根際繁殖，即根際的

殖民化；（2）根毛細胞變形彎曲；（3）細菌誘導根毛細胞形成一種管狀結構—侵染線；（4）根皮層細胞分裂形成根瘤原基；（5）根瘤原基分化形成各種根瘤組織，最后形成成熟的固氮根瘤。16根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

當豆科植物在幼苗期，土壤中的根瘤菌便被其根毛分泌的有機物吸引而聚集在根毛的周圍，并大量繁殖。同時產生一定的分泌物，這些分泌物刺激根毛，使其先端卷曲和膨脹，同時，在根菌瘤分泌的纖維素酶的作用下，根毛細胞壁發(fā)生內陷溶解，隨即根瘤菌由此侵入根毛。在根毛內，根瘤菌分裂滋生，聚集成帶，外面被一層粘液所包，形成為感染絲，并逐漸向根的中軸延伸。同時，在根瘤菌的刺繳下，根細胞相應地分泌出一種纖維素，包圍于感染絲之外，形成了具有纖維素鞘的內生管，又稱侵入線。根瘤菌順侵入線進入幼根的皮層中。

在皮層內，根瘤菌迅速分裂繁殖，皮層細胞受到根瘤菌侵入的刺繳，也迅速分裂，產生大量的新細胞。致使皮層出現局部的膨大。這種膨大的部分，包圍著聚生根瘤菌的薄壁組織，從而形成了外向突出生長的根瘤。

之后，含有根瘤菌的薄壁細胞的細胞核和細胞質逐漸被根瘤菌所破壞而消失，根瘤菌相應地轉為擬菌體(bacterioid)。具體過程：17根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

主根瘤菌剛剛進入豆科植物根部的時候，并不能固氮，只能發(fā)展到擬菌體階段，才能進行固氮作用。

在根瘤內，根瘤菌從豆科植物根的皮層細胞中吸取碳水化合物、礦質鹽類及水分。以進行生長和繁殖。同時它們又把空氣中游離的氮通過固氮作用固定下來，轉變?yōu)橹参锼芾玫暮衔铮┲参锷钏?。這樣，根瘤菌與根便構成了互相依賴的共生關系。18根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制（1）根際的殖民化根瘤菌對豆科植物根際的殖民化是由細菌的趨化性和根分泌物刺激根瘤菌生長的潛力來決定的，關于趨化性的信號機理還不清楚。選擇吸附學說認為，根瘤菌對豆科寄主植物與非寄主植物根毛吸附的選擇性，是致瘤專化性的重要原因，一種根瘤菌或其特定菌系（菌株）只能特異性地侵染其來源寄主和少數其他寄主并誘發(fā)根瘤。5.共生固氮各階段的信息傳遞和基因表達19根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制（2）根毛細胞變形和卷曲

有兩種mRNA體外翻譯蛋白：RH-42和RH-44只在接種后的根毛細胞中得到增強，這兩種蛋白質可能和根毛變形與卷曲有關，而根瘤菌能促進根毛細胞發(fā)育。RH-42基因的誘導表達和RH-44基因表達的增強需要nod基因產物的存在。

分離純化的結瘤因子在高于1nmol/L的濃度可以誘導其宿主植物根毛變形。研究表明，結瘤因子的脂肪酸鏈是其誘導根毛變形所必需的，而脂肪酸鏈的結構相對來說不是很重要。

對根毛變形和卷曲有關的基因表達的研究主要是，通過比較接種野生型根瘤菌和nodABC突變體的，或者未接種的根毛細胞mRNA的體外翻譯蛋白圖譜的差異來完成的。20根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制（3）侵染和侵染線的形成

隨著侵染線向根毛基部生長，在被侵染部位高度液泡化的根皮層細胞被激活，這些活化的細胞進行細胞質重排，形成橫跨中央大液泡的輻射狀胞質橋，這種胞質橋被認為是“為侵染線通過作準備”，因而被稱為前侵染線。

侵染線,即在根毛卷曲部位植物細胞壁局部水解，細胞質膜向內生長，同時新的細胞壁物質沉積在內陷的質膜處，形成一種管狀結構。細菌就是通過侵染線傳遞到根內皮層的植物細胞中去的。21根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

RNA原位雜交研究表明，PsENOD12基因特異地在根瘤菌接種后的根毛細胞和含侵染線的根皮層細胞中表達，而PsENOD5基因只在侵染線前部的皮層細胞中表達。ENOD12和ENOD5編碼的多肽都含有較高的脯氨酸。

ENOD12多肽的大部分是由重復的Pro-Pro-Gln-Lys-Glu和Pro-Pro-His-Lys-Lys2種五肽單位組成，在該蛋白的N-端有一個可能的信號肽。這些特征表明，ENOD12多肽很可能是富含（羥）脯氨酸的細胞壁蛋白，因此很可能是侵染線和為侵染線形成作準備的細胞壁組成部分。

ENOD5蛋白在其N-端也有潛在的信號肽，它除了富含脯氨酸外，還含有較高的丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。這表明，ENOD5蛋白可能是一種類似阿拉伯半乳聚糖蛋白的蛋白質，因而ENOD5可能是侵染線壁或膜的組成部分。分離純化的結瘤因子能誘導與侵染有關的結瘤素基因ENOD12和ENOD5，但不能誘導侵染線形成。22根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

對根瘤菌的誘變研究證明，細菌表面物質在侵染過程中起重要作用。

與EPS,LPS和葡聚糖合成有關的突變體一般不能有效地侵染植物細胞，如純化的EPS可以與三葉草根瘤菌EPS突變體互補，使該突變體獲得形成固氮根瘤的能力。缺少O-抗原的豌豆根瘤菌LPS突變體在箭舌豌豆上形成小的無效根瘤，而且細菌不能從侵染線中釋放到植物細胞中去，說明含O-抗原的LPS對細菌的釋放是非常重要的。

不能分泌環(huán)化葡聚糖的豌豆根瘤菌突變體誘導植物形成小的根瘤，在這種根瘤中只有少量侵染細胞，而且與植物防衛(wèi)反應有關的基因—苯基苯乙烯酮合酶(CHS)基因在侵染細胞周圍的細胞中表達了。由此證明：環(huán)化葡聚糖在避免植物的防衛(wèi)反應中起作用。另外，環(huán)化葡聚糖也與細菌的滲透適應有關，說明它在為細菌創(chuàng)造適當生長環(huán)境中起一定作用。23根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制（4）根瘤原基和分生組織的形成

在根瘤菌侵染根毛細胞的同時，根皮層細胞也被激活并開始細胞分裂。哪些皮層細胞分裂，以及形成什么樣的根瘤是由宿主植物決定的，而不是由根瘤菌決定的。根內皮層細胞分裂構成根瘤原基，根外皮層細胞被激活形成前侵染線結構。侵染線通過前侵染線向根瘤原基生長并分叉，根瘤原基基部的細胞首先被侵染。而在根瘤原基頂端的細胞則很小，并富含細胞質，構成頂端分生組織。

在根皮層細胞分裂形成根瘤原基時，一些植物基因得到特異性表達，如早期結瘤基因ENOD12、ENOD40。PsENOD12不僅在含侵染線的細胞中表達，而且也在根瘤原基細胞中表達。PsENOD40的表達模式和PsENOD12相似。這2個基因都不在分生組織中表達，所以它們可以作為分子標記來區(qū)別根瘤原基和分生組織。除了在根瘤原基的誘導表達外，PsENOD40也在面對根瘤原基的根中柱鞘細胞中表達，因此該基因有可能控制中柱和根皮層之間的物質運輸和信息傳遞。結瘤因子能夠誘導根內皮層，特別是對著原生木質部的部分，形成根瘤原基。早期結瘤素基因PsENOD12和PsENOD5的表達模式與結瘤因子誘導根瘤原基的形成是一樣的。因此，結瘤因子可能是根瘤原基形成和早期結瘤素基因表達所需的唯一的細菌信號分子。24根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制（5）根瘤發(fā)育

在根瘤的生活周期中，分生組織連續(xù)不斷地向基部分化形成中央組織和外周組織。中央組織是被根瘤菌侵染的組織，而外周組織不是。它包括根瘤皮層、內皮層和根瘤薄壁組織，后者是根瘤維管束存在的地方。?中央組織

分生組織不斷地分化形成根瘤組織，其結果是中央組織含有處于不同發(fā)育時期的細胞。據此可將其分為5個區(qū)段，即頂端分生組織、固氮前區(qū)、間隔區(qū)、固氮區(qū)和衰老區(qū)。目前為止，分離到的結瘤素基因沒有一個只在根瘤頂端分生組織中特異表達。CHS基因只在根瘤分生組織頂端的一至二層細胞及其附近的根瘤皮層細胞中表達，因此CHS的表達標明了分生組織的上限。PsENOD12只在固氮前區(qū)的上部表達（第1層細胞即達到最高水平），這表明在分生組織和固氮前區(qū)之間可以作明確的區(qū)分，并可作為分生組織的下限。25根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

而PsENOD5在所有固氮前區(qū)的侵染細胞中表達，且在該區(qū)的基部達到最高。而PsENOD40則在整個固氮前區(qū)具有相同的表達水平。在從固氮前區(qū)向間隔區(qū)過渡時，以上3個結瘤素基因的表達水平突然降低。

在固氮前區(qū)的上部，根瘤菌nod基因表達了，而在其基部不表達。這表明，nod基因在侵染線或剛釋放的根瘤菌中是表達了的，進而結瘤因子可能是在根瘤的該區(qū)合成的。免疫細胞化學研究證明，該基因編碼的蛋白主要存在于侵染線中和剛釋放的根瘤菌外膜上，而在固氮根瘤菌中則不存在。

有幾個結瘤素基因的表達開始于固氮前區(qū)的基部而持續(xù)到固氮區(qū)，比如PsENOD3、PsENOD14和豆紅蛋白基因Lb。PsENOD3和PsENOD14的表達始于固氮前區(qū)的上部，在間隔區(qū)達到最高水平，而在間隔區(qū)向固氮區(qū)過渡時表達開始下降。Lb基因在固氮前區(qū)的基部開始表達，在間隔區(qū)開始時達到最高水平，而且在整個固氮區(qū)保持這一水平。26根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

固氮前區(qū)向間隔區(qū)的過渡是以淀粉積累的開始與根瘤菌基因ropA和幾個結瘤素基因表達的急驟下降，及幾個晚期結瘤素基因PsENOD6和根瘤菌基因nifH開始表達為標志的。PsENOD6和nifH的表達始于間隔區(qū)的第1層細胞，并且一開始就達到最高水平。

盡管已研究過的基因沒有一個是特異地在從間隔區(qū)向固氮區(qū)過渡時表達，但PsENOD3/14mRNA濃度在這時降低。結瘤素基因，如PsENOD6、Lb、根瘤菌基因nifH都在固氮區(qū)表達了。

對根瘤衰老機理的分子研究還很不深入，但可能在其他衰老植物器官中表達的基因（如編碼水解酶的基因）極可能也在根瘤衰老過程中表達。?外周組織

大部分結瘤素基因是在根瘤中央組織中表達的，只有2個早期結瘤素基因，即ENOD2和ENOD40在外周組織中表達，其中ENOD2特異地在根瘤薄壁組織中表達。27根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制6.存在問題及展望6.1結瘤因子作用機理

根瘤菌產生的結瘤因子被認為是一類新型的植物生長調節(jié)因子，無論是其粗提物還是純化的組分都具有較為廣泛的生物學功能：（1）能誘導根毛變形、分支、卷曲；（2）抑制根的生長，形成粗短根；（3）誘導侵染線形成；（4）苜蓿、豌豆的根瘤菌結瘤因子NodRm,NodR1能誘導根部內皮層細胞分

裂和形成根瘤原基，純化的NodRm還能繼續(xù)誘導到形成根瘤，而且在結

構上與菌體感染形成的根瘤相同；（5）增加根系分泌物濃度水平；（6）誘導植物早期結瘤素基因表達，包括ENOD5和ENOD12。28根瘤菌和植物(豆科)之間的相互作用分子機制

由此可見，結瘤因子的生物學功能大致上涉及了根瘤菌正常侵染過程的各個階段，但其具體作用機理卻不很清楚。

有人認為，豆科植物存在可識別不同結瘤因子的專一性受體，但尚缺乏足夠的實驗證據。新近的研究結果證明：結瘤因子大分子骨架上的不同側鏈基團是決定細菌與宿主植物間相互識別的關鍵因素，根瘤菌細胞中一系列結瘤基因編碼能夠合成Lipochitooligosacc