分子生物學(xué)7-課件

RNA的轉(zhuǎn)錄合成-

真核生物的RNA轉(zhuǎn)錄專業(yè)：生物技術(shù)院系：生命科學(xué)學(xué)院2023/7/27MultipleformsofeukaryoticRNApol.MorepromotersEnhancers,silencersetccis-elementsandtrans-fators

真核基因轉(zhuǎn)錄的特點單順反子聚合酶高度分工Trans-factorsCis-elements真核基因的轉(zhuǎn)錄以正調(diào)控為主。真核生物的RNA聚合酶三種不同的RNA聚合酶根據(jù)它們對α-鵝膏蕈堿（α-amanitin）的敏感性不同分為RNA聚合酶I、II、III。

對抑制物的敏感性

酶的種類

對高濃度α-鵝膏蕈堿敏感

RNA聚合酶III

對低濃度α-鵝膏蕈堿敏感

RNA聚合酶II對α-鵝膏蕈堿不敏感

RNA聚合酶I

定位及產(chǎn)物PolymeraseIImakesHeterogeneousnuclearRNA(hnRNA)RNApolymeraseinEukaryotes

RNApol.I,II,IIIL’with78%±homologousbetween3RNApol.I,II,IIIL’~β’ofprokaryoteRNApol.β(功能相似)IncludingL,L’subunit&7-12smallsubunitsRNApolII(B);---Forpre-mRNAtranscription---Locatedinnucleoplasm---L’maximumsubunit240kd&havespecificCOOH-endnamedCTD(CarboxylTerminalDomain)onlyinRNApolII---CTD-end;7aarepeats&highfrequencyphosphorylationTyr—SerP—Pro—ThrP—SerP—Pro—SerP

Yeast26XDrosophila44Xrepeatunitof7aa/inCTDRat&Human52X

CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化，并且可逆。磷酸化的RNApolⅡ被稱為ⅡA非磷酸化的RNApolⅡ稱為ⅡBCTD參與轉(zhuǎn)錄→ⅡB→ⅡA→使RNApol易于離開啟動子進入延伸過程（10倍）去磷酸化的RNAIIpol（B）在轉(zhuǎn)錄起始時結(jié)合于啟動子，磷酸化的RNAIIpol(A)在延伸過程中有作用。定義：RNA聚合酶和基本轉(zhuǎn)錄因子（bTF）的結(jié)合區(qū)域，它們共同組裝成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。PromotersThreeeukaryoticRNApolymeraseshave:DifferentstructuresTranscribedifferentclassesofgenesExpectthatthe3polymeraseswouldrecognizedifferentpromotersClassIIPromotersPromotersrecognizedbyRNApolymeraseII(classIIpromoters)aresimilartoprokaryoticpromotershavetwoparts:Corepromoterhaving4elementsUpstreampromoterelementUPECorePromoterElements–TATABoxTATAboxFoundonthenontemplatestrandVerysimilartotheprokaryotic-10boxTherearefrequentlyTATA-lesspromotersHousekeepinggenesthatareconstitutivelyactiveinnearlyallcellsastheycontrolcommonbiochemicalpathwaysDevelopmentallyregulatedgenesCorePromoterElementsInadditiontoTATAbox,corepromotersare:TFIIB

recognitionelement(BRE)Initiator(Inr)Downstreampromoterelement(DPE)AtleastoneofthefourcoreelementsismissinginmostpromotersTATA-lesspromoterstendtohaveDPEsandhaveGCboxtocompensateforthelackofTATAboxPromotersforhighlyspecialized(luxury)genestendtohaveTATAboxes

PromotersforhousekeepinggenestendtolackthemTATA區(qū)主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確起始，如果該區(qū)缺失或發(fā)生突變則導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始位點不確定。在二類啟動子里，TATAbox是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體蛋白組裝的位置。第一個結(jié)合在該位點的蛋白是TBP，當(dāng)其結(jié)合后，會增加其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的幾率。UpstreamElementsUpstreampromoterelementsareusuallyfoundupstreamofclassIIcorepromotersGCboxesbindtranscriptionfactorSp1-110~-80CCAATboxesbindCTF(CCAAT-bindingtranscriptionfactor)-80~-70Upstreampromoterelementscanbeorientation-independent,yetarerelativelyposition-dependentATATAACCAATGCCACACCC

或GGGCGGG+1轉(zhuǎn)錄起點TATAboxCAATboxGCbox增強子-35~-25-80~-70-110~-80promotermodel(RNAPolII)GCbox可能有多個，如果發(fā)生突變或者缺失，則會對活性有很大影響，比如SV40earlygene具有6個GCbox，丟失1個活性只有33%，丟2個則有13%，3個則無活性GCbox具有位置依賴性，但沒有方向依賴性。如果離開TATAbox太遠則不起作用。CCAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。CAAT區(qū)域任何堿基改變對轉(zhuǎn)率起始頻率和強度影響都很大。另外在TATA區(qū)和UPE區(qū)域插入核苷酸序列也會降低活性。這2個區(qū)域方向?qū)τ谵D(zhuǎn)錄的影響不大。ClassIPromotersClassIpromotersarenotwellconservedinsequenceacrossspeciesGeneralarchitectureofthepromoteriswellconserved–twoelements:CoreelementsurroundingtranscriptionstartsiteUpstreamcontrolelement(UCE)100bpfartherupstreamSpacingbetweentheseelementsisimportantRNApolⅠpromoter+1+6-31-100UCE:50~80bpCorepromoterPre-rRNAgeneEnhancetranscriptionEssentialfortranscriptionClassIIIPromotersRNApolymeraseIIItranscribesalotofshortgenesThesehavepromotersthatliewhollywithinthegenesThereare3typesofthesepromotersPromotersofSomePolymeraseIIIGenesTypeI(5SrRNA)has3regions:BoxAShortintermediateelementBoxCTypeII(tRNA)has2regions:BoxABoxBTypeIII(nonclassical)U6snRNA基因基本轉(zhuǎn)錄因子bTF組成型轉(zhuǎn)錄因子廣泛的DNA結(jié)合蛋白一般是針對polII催化轉(zhuǎn)錄必需TFRNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄因子：作用于TATA框的轉(zhuǎn)錄因子至少有7種，即TAIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ。TFIID：TBPTATA-bindingprotein，

+TAFsTBP相關(guān)因子（TBP－associatedfactors,TAF）RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄因子需要兩種轉(zhuǎn)錄因子

上游結(jié)合因子（upstreambindingfactor,UBF）

選擇因子1（SL1）

4種蛋白質(zhì)組成，包括TATA框結(jié)合蛋白（TATA-bindingprotein，TBP）

UBF：特異地識別核心啟動子和上游調(diào)控元件（UCE）中富含GC對的區(qū)域。

SL1：單獨并沒有識別特異DNA序列的功能，在UBF和DNA結(jié)合后，SL1才可結(jié)合上來。只有當(dāng)兩種輔助因子與DNA結(jié)合后，RNA聚合酶I才能與核心啟動子結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄。InitiationofpolⅠgene’stranscriptionUBFUBFSL1POLⅠNOTE:UBF----upstreambindingfactorSL1----selectivityfactorRNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄因子兩種內(nèi)部啟動子的轉(zhuǎn)錄起始需要三種輔助因子

TFⅢA一種含9個鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白

TFⅢB

由TBP和BRT、B”等蛋白構(gòu)成

TFⅢC至少5個亞基以上

TFⅢB和TFⅢC是幾類RNApolⅢ共同需要的轉(zhuǎn)錄因子

TFIIIA因子主要是針對5SrRNA的轉(zhuǎn)錄來講常用。

TFⅢB是真正的轉(zhuǎn)錄起始因子，A和C僅僅是組裝因子，作用是協(xié)助TFIIIB的定位。一般模式TheRoleofTBP

三種RNApol的轉(zhuǎn)錄起始均需要TBP★所有RNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄起始都需要TBP★在RNApolⅠ的轉(zhuǎn)錄起始過程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApolⅠ的作用★RNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始由TBP識別TATA框

TBP起定位作用,所以又稱定位因子（positioningfactor）SpecificityofTBPdependsonassociatedTAFsDNA結(jié)合域果蠅克隆基因產(chǎn)物組裝的TFIIDRNApolymerasesarepositionedatallpromotersbyafactorthatcontainsTBP.TBPisauniversalfactorTBP非常保守，TATAbox結(jié)合域位于其C端，富含堿性氨基酸，N端分化很大可結(jié)合很多TAFs。TBP結(jié)合于TATA框小溝，含有TATAbox的啟動子需要TBP，不含TATAbox的啟動子也需要TBP。TheTAFII250andTAFII150helptheTFIIDbindtotheinitiatorandDPEofpromotersAlsoaidinTFIIDinteractionwithSp1thatisboundtoGCboxesupstreamofthetranscriptionstartsiteTheyenableTBPtobindto:TATA-lesspromotersthatcontainelementssuchasaGCbox---RNApolII+>20TFIIs

逐級組裝

TIC→轉(zhuǎn)錄啟動

(TranscriptionalInitiationComplex)TBPControlUPE（upstreampromoterelements）effectforbasictranscriptionTFIID：Asortofproteincomplex(TBP&>8TAF)II類基因轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝及起始TATA+1

Wildsminorgroove

TFIIATBPofD

pre-TIC

TFIIA：BindstoTFIIDEnhancesTFIIDbindingtoTATAboxStabilizingtheDNA-TFIIDcomplex

TFIIB

BasicTIC

TFIIB;OnceTFIIDhasboundtoDNA,TFIIBbindstoTFIIDandbindstoTBPofTFIIDandRNApol.IITFIIF;IncludingtwosubunitsofRAP30,RAP74BindingandrecruitingRNApolIItoassembleTICPromotingRNAelongationbyitshelicase(ATPase)

A,DTFIIFRNApolIITFIIH;Largecomplexmadeupof>5subunitsHelicaseactivity(ATPase)&kinaseactivity

PhosphorylationofCTDofRNApolIIO

DNArepair

TFIIE;AssociatewithTFIIHkinase

completeTIC

EHmRNA

Promoterclearance

EHBDATranscriptionstartingTATA+1

Wildsminorgroove

TFIIATBPofD

pre-TIC

TFIIFRNApolIITFIIB

BasicTIC

conclusionmRNA

Promoterclearance

EHBDATranscriptionstartingcompleteTIC

EHRNA聚合酶II的延伸因子TFIIsRNA聚合酶并非以固定速率轉(zhuǎn)錄，有時會在某地暫停，TFIIs的作用可能是限制RNA聚合酶的暫停，促進轉(zhuǎn)錄延伸。促進RNA聚合酶的校對功能。RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄激活因子通用轉(zhuǎn)錄因子只能低水平的起始轉(zhuǎn)錄，激活因子對于轉(zhuǎn)錄起始頻率和基因的時空表達都有調(diào)節(jié)作用。EnhancersandSilencersTheseareposition-andorientation-independentDNAelementsthatstimulateordepress,respectively,transcriptionofassociatedgenesAreoftentissue-specificinthattheyrelyontissue-specificDNA-bindingproteinsfortheiractivitiesSomeDNAelementscanacteitherasenhancerorsilencerdependingonwhatisboundtoit例識別CAATbox的一系列因子稱為CTF家族。海膽的卵中，組蛋白基因H2B啟動子中含有2個CAATbox，這個基因僅僅在精子發(fā)生時表達。而從睪丸和胚胎中都有CAAT結(jié)合蛋白可以分離，卻只有睪丸中的CAAT結(jié)合蛋白才能結(jié)合CAATbox，胚胎中則不行。原因在于睪丸內(nèi)CTF因子可以激活H2B基因轉(zhuǎn)錄，而胚胎中的CTF因子被CDP（CAAT取代蛋白）搶先占據(jù)了啟動子位置，阻止了起始復(fù)合物的組裝，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄無法進行。增強子

位于啟動子上游或下游甚至基因內(nèi)的一段DNA順序，它可以增強啟動子發(fā)動轉(zhuǎn)錄的作用，從而明顯地提高基因轉(zhuǎn)錄的效率。增強子的功能及作用特點1）能遠距離增強啟動子的活性；2）在啟動子的上游和下游均起作用；3）無方向性；4）對啟動子的影響無嚴(yán)格的專一性。ActivatorscanstimulateorinhibittranscriptionbyRNApolymeraseIIThestructureofthemiscomposedofatleast2functionaldomainsDNA-bindingdomainTranscription-activationdomainManyalsohaveadimerizationdomainActivatorsDNA-BindingDomainsDNA-bindingdomainshaveDNA-bindingmotifPartofthedomainhavingcharacteristicshapespecializedforspecificDNAbindingMostDNA-bindingmotifsfallinto3classes1stZincfingerThereareatleast3kindsofzinc-containingmodulesthatactasDNA-bindingmotifsAlluseoneormorezincionstocreateashapetofitana-helixofthemotifintotheDNAmajorgroove在進行TFIIIA和幾種其它的DNA結(jié)合蛋白的氨基酸序列分析時，發(fā)現(xiàn)相同的、重復(fù)的氨基酸序列。這個大約含有30個氨基酸的序列折疊成一種包含四面體配位的鋅離子的結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)稱之鋅指鋅指目前發(fā)現(xiàn)了三種：Cys2/His2型、Cys2/Cys2型和2鋅離子型Zn位于Cys2和His2組成的四面體中單個鋅指的三維結(jié)構(gòu)是由一個α螺旋和一個β折疊片組成的a螺旋與DNA雙螺旋的大溝接觸來調(diào)控轉(zhuǎn)錄Cys2/His2型共有序列為：Cys--X2-4--Cys--X3--Phe--X5--Leu--X2--His--X3-5—HisCys2/Cys2型共有序列為：Cys—X2--Cys—X1-3--Cys—X2–Cys酵母的GAL4型蛋白：6個Cys和2個Zn，與大溝結(jié)合，二聚化位點緊鄰DNA結(jié)合域成a螺旋。并非所有鋅指蛋白都是DNA結(jié)合蛋白，有些則可與RNA結(jié)合，有些則沒有任何關(guān)系。2ndhelix-turn-helix同源異型域，一類DNA序列編碼60個氨基酸，幾乎在所有真核生物中都有。含有3個a螺旋，第2，3個螺旋成h-t-h型結(jié)構(gòu)3rdbZIPandbHLHMotifsAnumberoftranscriptionfactorshaveahighlybasicDNA-bindingmotiflinkedtoproteindimerizationmotifsLeucinezippersHelix-loop-helixExamplesinclude:CCAAT/enhancer-bindingproteinMyoDprotein一個HLH結(jié)構(gòu)是由一個短的α-螺旋通過一個環(huán)與另一個長的α-螺旋組成的。HLH二聚體也有亮氨酸拉鏈區(qū)，兩個HLH可以是相同的（形成同源二聚體），也可以不同（形成異源二聚體）。但與DNA結(jié)合的是從二聚合區(qū)分開的兩個含有許多堿性氨基酸殘基的α-螺旋。缺少與DNA結(jié)合所需要的堿性區(qū)蛋白是bHLH活性的顯性失活阻遏物（dn-HLH）。Leucinezippers許多轉(zhuǎn)錄因子常常是以二聚體的形式識別和結(jié)合DNA的靶位點這種二聚體一部分是疏水區(qū)，另一部分是親水區(qū)，可以說是一種“兼性”的二聚體。疏水區(qū)是兩個相同α-螺旋序列靠疏水相互作用彼此纏繞形成的二聚體區(qū)。親水區(qū)是負責(zé)與DNA結(jié)合的部分，這部分是分開的兩個α-螺旋，螺旋中含有很多堿性氨基酸殘基。整個二聚體結(jié)構(gòu)象一個倒置的Y疏水區(qū)中的兩個α-螺旋序列的最大特點是螺旋中每隔6個氨基酸殘基就出現(xiàn)一個亮氨酸殘基，由于α-螺旋中每一轉(zhuǎn)含有3.4個氨基酸殘基，所以第7個氨基酸殘基基本上是處于螺旋的同一側(cè)面，這樣的相鄰α-螺旋中