流式細胞術(shù)質(zhì)量控制

流式細胞術(shù)質(zhì)量控制流式細胞術(shù)（flowcytometry,FCM）越來越廣泛的應(yīng)用在臨床檢驗中。由于臨床檢驗本身的性質(zhì)，它要求臨床檢驗的管理者和操作人員必須把好常規(guī)操作已經(jīng)結(jié)果分析的質(zhì)量關(guān)。同時還必須懂得如何判斷分是在控還是失控。作為臨床檢驗工作，其工作的質(zhì)量標準就是使檢驗的結(jié)果最佳地符合病人有無病變的實際情況。在臨床檢驗中分為分析前、分析中、分析后的質(zhì)量控制。分析前的質(zhì)量控制主要內(nèi)容是標本采集、保存和傳送等；分析中的質(zhì)量控制即實驗操作過程的控制；分析后的質(zhì)量控制主要是對數(shù)據(jù)結(jié)果的處理，對檢驗結(jié)果的可信度評價和及時將報告送給臨床并聽取反饋意見。為此，從臨床醫(yī)師開出化驗單，，直至拿到檢驗報告的整個過程都在質(zhì)量控制的范疇之中，即所謂全程質(zhì)量控制。它包括質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評估。質(zhì)量保證，指圍繞所有的步驟，監(jiān)測和評估實驗室規(guī)章制度與操作流程的效力。主要利用質(zhì)量控制和質(zhì)量評估。質(zhì)量控制指建立一套完善的實驗室監(jiān)控方法，保證結(jié)果的可靠性，提高準確度、精密度、重復(fù)性和室間結(jié)果的可比性。對于一個實驗，應(yīng)建立一套包括各種可變因素（儀器設(shè)備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等）的操作規(guī)程。質(zhì)量評估是由一個區(qū)域性的、國家的或國際性的機構(gòu)，組織通過一系列的方法來比較實驗室內(nèi)或不同實驗室之間的結(jié)果而建立的一套評價系統(tǒng)。其主要目的是建立室間和儀器設(shè)備之間的可比性。當一個標準品或參考標準存在時，質(zhì)量評估通常被稱為熟練度測試。因此，嚴格的質(zhì)量控制是先進的臨床檢驗分析技術(shù)真正發(fā)揮作用的保證。FCM作為一項先進的檢測技術(shù)，對質(zhì)量控制自然也不例外。目前，F(xiàn)CM應(yīng)用于臨床檢驗的項目主要集中在幾個方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴細胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27檢測、陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）的檢測等等。2,細胞DNA、RNA檢測及細胞周期分析，包括DNA倍體檢測、細胞周期分析、網(wǎng)織紅細胞檢測、網(wǎng)織血小板檢測等等。3,定量分析，包括愛滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監(jiān)測中CD3的絕對定量、干細胞移植中的CD34的定量等等。FCM實驗的質(zhì)量控制自然也包括儀器設(shè)備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等整個實驗過程的質(zhì)控。一、 流式細胞儀的校準流式細胞儀的校準包括流路的穩(wěn)定性、光路的穩(wěn)定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉(zhuǎn)換的線性和穩(wěn)定性。對儀器的校準主要是利用標準微球進行監(jiān)測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標記或者擁有定量免疫球蛋白的結(jié)合位點。這種制成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球,已成為流式質(zhì)控中的一個常用的標準品oBECKMANCOULTER公司擁有儀器校準所需全部標準微球（見表一）。另外，在顏色補償方面，BECKMANCOULTER公司的流式細胞儀除了可以用標準補償試劑來完成外，還可以直接利用生物樣品進行自動顏色補償，這使多色標記變得非常容易oBECKMANCOULTER公司的流式細胞儀所帶的全程質(zhì)控軟件，使日常儀器性能的質(zhì)控以及質(zhì)量控制評估都可自動完成。二、 實驗操作過程的質(zhì)控（一）樣本的質(zhì)量控制用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質(zhì)控最困難的環(huán)節(jié)之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應(yīng)棄用。第二，單細胞懸液的獲?。和庵苎凸撬璐┐桃簽樘烊粏渭毎麘乙海换顧z組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對于需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎(chǔ)上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝；對于血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。第四，樣本的保存：理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對于只作胞內(nèi)染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：1）抗原性不被溶血過程改變；2）溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結(jié)合的動力反應(yīng)未受影響；3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結(jié)果。密度梯度離心法，靶細胞回收較好并可能得到富集，同時去除紅細胞、碎片等，但費時，某些重要細胞群體可能被選擇性丟失。第六，細胞與抗體的比例:廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細胞數(shù)量在5X105?1X106范圍內(nèi)。有些標本沒有足夠的細胞，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，每個實驗室應(yīng)根據(jù)不同于廠家推薦的方法，調(diào)整細胞與抗體用量，得到最適的細胞/抗體比例。第七，細胞活性的鑒定:死細胞對許多抗體均有很強的非特異性染色，這就使樣本細胞活性檢測變得非常重要，尤其是經(jīng)過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種:1）實時的流式檢測:利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidiummonoacide）進行死細胞染色，而活細胞拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因為在488nm激發(fā)下，其最大發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC或PE進行多色標記。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區(qū)分變得困難。因此，對于染色并在固定后12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩(wěn)定的共價結(jié)合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。2）手工檢測：使用Trypanblue或其他細胞活性染料。3）使用專門的儀器進行檢測。如Vi-cell.（二）、選擇和確定單抗組合流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結(jié)果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則:1）所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達少的抗原應(yīng)盡可能選擇熒光強度強的熒光素標記。3）了解不同抗體的細胞反應(yīng)譜，以及染色模式。根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結(jié)合（如通過空間構(gòu)型的阻礙），所以對所用抗體組合，應(yīng)先了解每個抗體在對照細胞上單色標記的表達情況。5）對于臨床實驗盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用于體外診斷實驗。在我國，用于體外診斷的試劑還必須取得國內(nèi)的SDA認證。這樣，一個抗體組合內(nèi)的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F(xiàn)/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那么，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對于臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。如，T細胞亞群檢測的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）檢測的CD55、CD59；血小板無力癥（GT）檢測的CD41、CD61等等。但對于白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止也沒有統(tǒng)一的抗體組合。在2000年國際細胞分析學會（ISAC）大會上，臨床血細胞計數(shù)協(xié)會組織了一次國際專家會議，以期對檢測血液淋巴系統(tǒng)腫瘤所需最少、最有效的單抗數(shù)達成共識。75%與會者一致認為，對于慢性淋巴系統(tǒng)增殖性疾?。–LD）有9種單抗：CD5,CD19,k入CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對初診來說是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對于急性白血?。ˋL），75%的與會者認為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO,CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對初步鑒別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對某些病例有用。幾乎所有的投票者都認為，要對急性白血病完善分類所需單抗的恰當數(shù)量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無統(tǒng)一規(guī)定（如表二）。大會多數(shù)發(fā)言者（11/13）指出，對已確診病人的監(jiān)護和分期來說，僅需較少單抗?？贵w的質(zhì)量控制是實驗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？贵w的質(zhì)量包括其特異性、靈敏度、精密度。對這一些，一些商業(yè)化的公司對常用單抗的檢驗均推出了一系列質(zhì)控物。如BECKMANCOULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見表一）。（三）染色方法細胞表面染色：大多數(shù)免疫表型分析均采用此方法。但由于許多抗原也同時存在細胞內(nèi)，所以在細胞表面抗原檢測時應(yīng)特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。表面標記又分溶血前標記和溶血后標記。若紅細胞對標記有影響或血漿成分對標記有影響的，適合溶血后標記，但要注意溶血劑膜抗原的影響，所以，溶血劑一般不含固定劑。如免疫球蛋白輕鏈檢測和陣發(fā)性血紅蛋白尿的檢測等。細胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT,MPO,cCD3,cCD79a。胞內(nèi)染色的關(guān)鍵是使細胞膜通透，把抗體或核酸染料導(dǎo)入胞內(nèi)而不影響細胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)抗原與相應(yīng)抗體的結(jié)合力和核酸與染料的結(jié)合。某些適用于胞內(nèi)染色的試劑可能不適于表面標記分析。通常胞內(nèi)染色不能與細胞活性的檢測同時進行，除非用EMA的方法。對于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小到能穿透到胞膜內(nèi)。對于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細胞染料，無需固定或透膜。胞膜和胞內(nèi)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。三、 數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀數(shù)據(jù)的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎(chǔ)上進行。由于流式細胞儀是基于對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償?shù)葏?shù)的設(shè)定直接影響結(jié)果。同型對照的設(shè)定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽性閾值的界定才比較準確，特別是對于弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體分析中參照物的設(shè)定非常重要，一般雞紅細胞作為內(nèi)參照物。為了結(jié)果的可靠性，對獲取的細胞量至少應(yīng)在10000-20000個。但不同的實驗?zāi)康膶τ讷@取的細胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應(yīng)獲取10000個細胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測，要求達到10-4數(shù)量級水平，則應(yīng)至少分析100000個細胞；干細胞移植中CD34的檢測，應(yīng)至少獲取100個CD34陽性細胞或75000個有核細胞。對于獲取的數(shù)據(jù)，應(yīng)保存在listmode文件中，便于分析。設(shè)門（gating）對于流式數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。設(shè)門實際就是確定分析區(qū)域。在DNA倍體分析中，設(shè)門實際就是圈定單個細胞，排除粘連細胞。對于細胞成分單一的標本（如培養(yǎng)細胞），設(shè)門比較簡單。但對于成分復(fù)雜的標本（如骨髓）而言，準確的設(shè)門就不那么簡單。前向散射光（FS）與側(cè)向散射光（SS）設(shè)門干擾因素較多，目前，越來越多的被免疫標記物加散射光設(shè)門所取代。如,CD45/SS設(shè)門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測、MRD監(jiān)測最佳的設(shè)門方法；CD19/SS設(shè)門對于成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。在數(shù)據(jù)分析中，百分率、熒光強度、DNA指數(shù)（DI）、多少個/ul是我們報告中常用的。百分率主要適用于檢驗指標集中在細胞有無的數(shù)量變化。如T細胞亞群檢測、網(wǎng)織紅細胞檢測等；熒光強度主要適用于檢驗指標的變化集中在細胞上抗原量的多少。如血小板無力癥（GT）的檢測、慢性淋巴細胞白血?。–LL）CD20的變化等。DI用于DNA倍體分析。而愛滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監(jiān)測中CD3的絕對定量、干細胞移植中的CD34的定量等等，最終都以多少個/ul的濃度形式表示出來。對于白血病/淋巴瘤免疫分型結(jié)果的分析，以前基本上都是以百分率的形式報告臨床，但單純的百分率結(jié)果并不能完整的反映腫瘤細胞的特性。因為20%人為認定的陽性判斷標準忽略了低于20%的弱陽性結(jié)果，以及忽略了陽性結(jié)果之間熒光強弱的差別，而這一切對于白血病/淋巴瘤的診斷和分型卻非常重要。目前，大多主張以文字描述抗原有無和強弱的報告方式，廢棄百分率的報告形式。四、 臨床檢驗的分析過程的質(zhì)量評價質(zhì)量控制也必須重視檢驗方法學的選擇和評價。任何一次實驗都一定有誤差，在一定意義上可以將誤差分為實驗方法學的系統(tǒng)誤差及除此之外的隨機誤差。質(zhì)