蛋白質(zhì)生化技術(shù)課件

蛋白質(zhì)生化技術(shù)SELDI蛋白指紋技術(shù)GSTPull-Down報告基因系統(tǒng)PTDs1編輯版ppt蛋白質(zhì)芯片-飛行質(zhì)譜系統(tǒng)及其

在分子生物學(xué)中的應(yīng)用2編輯版ppt背景介紹

蛋白指紋質(zhì)譜技術(shù)（SELDI，SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization，表面增強(qiáng)激光解吸技術(shù)）是2002年諾貝爾化學(xué)獎的核心技術(shù)，具有快速、簡單和靈敏等優(yōu)點(diǎn),它不僅可在腫瘤診斷中用于發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物、觀察治療效果,還可用于研究蛋白質(zhì)的修飾、相互作用、信號傳導(dǎo)和酶促調(diào)節(jié)等,從而實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平的大規(guī)模功能研究。3編輯版ppt傳統(tǒng)蛋白組學(xué)研究（2D-MS）的局限性由于外加電場下的PH梯度不穩(wěn)定，重復(fù)性差加樣量小，分離的蛋白質(zhì)很難鑒定可分析的蛋白質(zhì)最多約1500種，難以檢出蛋白質(zhì)中占很大比例的低豐度蛋白質(zhì)對于分離跨膜蛋白仍是技術(shù)難點(diǎn)電泳膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)很大部分包含一種以上蛋白，以依次鑒定單個蛋白斑點(diǎn)為基礎(chǔ)，限制了檢測通量消耗時間長，一次電泳要5小時以上對技術(shù)水平要求高，不能完全自動化染色轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作技術(shù)條件要求高，耗時，不適應(yīng)于大規(guī)模篩查和臨床檢測4編輯版pptSELDI技術(shù)的優(yōu)勢直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進(jìn)行分析同時快速發(fā)現(xiàn)多個生物標(biāo)記物微量樣品(asfewas2000cellsforLCMsamples)高通量的驗(yàn)證能力（with1000sofsamplesamonth）發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)測定疏水蛋白質(zhì):與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體5編輯版ppt特異性高：利用單克隆抗體芯片，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量可以定量：利用單克隆抗體芯片，由于結(jié)合至芯片上的抗體是定量的，故可以測定抗原量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析功能廣：

I.利用單克隆抗體芯片,可替代WesternBlotII.利用單克隆抗體芯片,可互補(bǔ)流式細(xì)胞儀不足的功能，如將細(xì)胞溶解，可測定細(xì)胞內(nèi)的抗原,而且靈敏度遠(yuǎn)高于流式細(xì)胞儀6編輯版ppt系統(tǒng)介紹

SELDI技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片－飛行時間質(zhì)譜儀器由三部分組成：蛋白質(zhì)芯片閱讀器（ProteinChipReader）飛行時間質(zhì)譜檢測系列（PBSIIC系列）分析軟件（ProteinChip軟件）。7編輯版ppt8編輯版ppt操作流程示意圖9編輯版ppt生物初樣品（血清/細(xì)胞裂解液）：蛋白質(zhì)通過親合作用結(jié)合到芯片的化學(xué)或生物位點(diǎn)上；清洗蛋白質(zhì)芯片：用水洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和緩沖液中的雜質(zhì)，以消除干擾；加能量吸收分子EAM（EnergyAbsorbMolecule）or“Matrix”：芯片經(jīng)室溫干燥后，加能量吸收分子EAM到每個點(diǎn)上，使其與蛋白質(zhì)結(jié)成混合晶體，以促進(jìn)蛋白質(zhì)在飛行時間質(zhì)譜檢測中的解吸附和離子化SELDI蛋白質(zhì)芯片的制備12310編輯版ppt飛行時間質(zhì)譜檢測激光解吸電離的方法將保留在芯片上的蛋白質(zhì)解離出來電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜被精確地測定出它們的質(zhì)量11編輯版pptProteinChipReader工作草圖12編輯版pptProteinChip

軟件13編輯版ppt化學(xué)表面芯片

分為疏水、親水、陽離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測未知蛋白，獲取指紋圖譜。化學(xué)表面芯片可以直接用粗生物樣品（血清、尿樣、體液）進(jìn)行分析，能同時快速發(fā)現(xiàn)多個生物標(biāo)記物，測定疏水蛋白質(zhì)特別是膜蛋白。芯片的種類14編輯版ppt生物表面芯片

生物表面芯片分為抗體－抗原、受體－配體和DNA－蛋白質(zhì)芯片等種類，可顯示與之相結(jié)合的抗原或者配體的不同分子量亞型，這種芯片的特異性高，可以定量。15編輯版ppt

蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)提供了一個單一、快速和特異的平臺，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的多個領(lǐng)域的強(qiáng)大平臺。能夠用于下列研究：生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、表達(dá)差異繪圖、作用差異繪圖、抗體抗原作用、DNA與蛋白的相互作用、蛋白鑒定和多肽作圖、蛋白質(zhì)純化、表位作圖、糖基化分析、磷酸化/信號傳導(dǎo)途徑分析、蛋白與蛋白之間作用、受體配體作用、毒性標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、臨床數(shù)據(jù)分析等。16編輯版ppt在發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物上的優(yōu)勢抓住了疾病的本質(zhì)，絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志物（Bio-marker），在SELDI技術(shù)中質(zhì)譜的峰值是對這些生物標(biāo)志物最直接的反映。有一套靈敏的檢測系統(tǒng)來檢測和識別這些微量的生物標(biāo)志物。17編輯版ppt發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物

能夠?qū)υS多不同的樣品進(jìn)行比較分析，軟件功能強(qiáng)大，分析獲得的譜圖可以多種形式表示，并應(yīng)用疊加合成等手段篩選出特別的差異峰，從而確定生物標(biāo)志物，該方法迅速便捷。18編輯版ppt蛋白質(zhì)純化

提供了便捷的蛋白質(zhì)純化方法，能夠優(yōu)化最佳色譜條件（如PH值、洗脫條件），對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的分離。19編輯版ppt蛋白質(zhì)鑒定從蛋白質(zhì)芯片對結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，或者事先對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行蛋白酶切處理，再結(jié)合到蛋白質(zhì)芯片。結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠得到消化片段的分子量，從數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索就能夠獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列信息。20編輯版ppt分子間作用預(yù)先對芯片的點(diǎn)進(jìn)行處理，偶聯(lián)抗體或者其他蛋白（或者其他的誘餌分子），制備定制芯片。將待檢測包含可能結(jié)合分子的溶液與芯片進(jìn)行雜交，洗脫后對結(jié)合上的綁定蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得結(jié)合蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。21編輯版ppt轉(zhuǎn)錄后修飾

能夠確定樣品中特定分子量的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的各種修飾對分子量的改變導(dǎo)致了獲得相應(yīng)峰的位移，從而精確表述蛋白質(zhì)的修飾狀況。22編輯版ppt臨床應(yīng)用

蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病，如癌癥、老年病、傳染性疾病、心血管病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診斷，其中應(yīng)用于癌癥的最多，被認(rèn)為是分子醫(yī)學(xué)的一場革新，極大的提高了各種疾病的診斷率。23編輯版ppt疾病的診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷

腫瘤：前列腺癌乳腺癌卵巢癌膀胱癌白血病肺癌腦癌大腸癌其它疾?。杭毙阅I功能衰竭急性心力衰竭,動脈硬化癥暴露在空氣中的毒素神經(jīng)精神病學(xué)：早老性癡呆憂郁癥精神分裂癥巴金森氏Huntington’s傳染?。篐IV鼠疫桿菌Yersiniapestis分支桿菌Mycobacterium柄細(xì)菌Caulobacter鏈球菌Streptococcus肉毒中毒Botulism盶病毒Prions黑死病病毒Yersinia24編輯版ppt臨床診斷腫瘤肝癌甲胎蛋白AFP91%89%

肺癌NSE82%95%

胃癌癌胚抗原CEA91%94%

前列腺癌PSA83%97%

乳腺癌癌抗原CA15393%91%

卵巢癌癌抗原CA12599%99%

腸癌癌胚抗原CEA83%92%

胰腺癌CA19982%85%

膀胱癌尿液檢測93%87%鼻咽癌92%97%食道癌84%91%喉癌97%97%腫瘤傳統(tǒng)標(biāo)志物靈敏度特異性SELDI腫瘤蛋白指紋25編輯版ppt發(fā)病機(jī)理研究

著名的艾滋病學(xué)家何大一教授借助SELDI技術(shù)，在3個月內(nèi)所定了α-defensin1，2，3三種蛋白對艾滋病有抑制作用，這是正常人體內(nèi)沒有的蛋白質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)使研制艾滋病蛋白抑制劑一直成為可能。乙肝病毒感染-肝硬化-肝癌是導(dǎo)致乙肝患者最終死亡的發(fā)病三步曲，通過SELDI，檢測乙肝病毒攜帶者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，發(fā)現(xiàn)三種疾病的質(zhì)譜峰，檢測其它樣品時靈敏度為80%，特異性為81.8%，這種手段無創(chuàng)傷，并且可以不間斷的跟蹤檢測，為正確治療提供科學(xué)可靠的技術(shù)依據(jù)。26編輯版ppt其他應(yīng)用新藥開發(fā)與藥理學(xué)研究，藥物毒性實(shí)驗(yàn)等，利用SELDI技術(shù)可以準(zhǔn)確的側(cè)到藥物中的特異基因，活性基因與滅活基因。對臨床用藥具有很好的有指導(dǎo)作用。基礎(chǔ)理論研究：蛋白質(zhì)的純化，蛋白質(zhì)的鑒定，蛋白質(zhì)功能的研究，已知樣品中某種功能蛋白，可通過該技術(shù)尋找功能蛋白。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，如有已知抗體、受體酶，可用該技術(shù)獲得其靶蛋白（抗原、配體和底物），形成DNA或者RNA結(jié)合蛋白的研究，確定抗原決定簇，蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化研究，用于尋找與疾病有關(guān)的磷酸化，蛋白及新型生物標(biāo)志物的開發(fā)與應(yīng)用等。27編輯版pptGSTPull-Down（谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)）方法尋找結(jié)合蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity28編輯版ppt背景蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學(xué)研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機(jī)體每個細(xì)胞的生命活動過程中。生物學(xué)中的許多現(xiàn)象如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity29編輯版ppt簡介GSTPull-down技術(shù)是近年來發(fā)展的一種敏感性及特異性均較高的體外鑒定兩蛋白之間相互作用的重要方法1991年由Kaelin的研究組最早應(yīng)用GSTPull-down技術(shù)在混合蛋白溶液尋找到結(jié)合蛋白利用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白對谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，從可能含有相互作用蛋白的溶液中純化相互作用的蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity30編輯版ppt實(shí)驗(yàn)步驟原核表達(dá)并純化GST融合的已知蛋白。同時，應(yīng)用放射性同位素（35S）對細(xì)胞裂解物進(jìn)行標(biāo)記。將GST融合蛋白與標(biāo)記好的細(xì)胞裂解物混合，同時加入谷胱甘肽偶聯(lián)球珠，溫浴使得融合蛋白的GST能夠與球珠結(jié)合。通過離心方法收集GST融合蛋白以及與其結(jié)合的可能的蛋白分子。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能夠從球珠上洗脫下來，溶解在SDS上樣緩沖液中。將獲得的混合物進(jìn)行SDS電泳，進(jìn)行放射自顯影或者蛋白染色，進(jìn)而轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)鑒定。還可應(yīng)用質(zhì)譜的方法對找到的結(jié)合蛋白進(jìn)行分析，確定未知蛋白的氨基酸組成，從而找到與已知蛋白結(jié)合的因子。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity31編輯版ppt應(yīng)用確定融合蛋白與未知蛋白間新的相互作用證實(shí)融合蛋白與已知蛋白質(zhì)間可能的相互作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity32編輯版pptGSTPull-Down檢測蛋白的作用原核表達(dá)的已知蛋白細(xì)胞裂解液中的未知蛋白質(zhì)應(yīng)用cDNA文庫，進(jìn)行體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫中的未知蛋白半定量檢測蛋白與蛋白的親和作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity33編輯版pptGSTProteinXGST35S-labledcelllysate(glutathione-sepharosebeads)(glutathione-sepharosebeads)35S-labledcelllysateGSTProteinXGSTGSTInteractat40CMicrofugetocollectcomplexesProteinBiochemistryLabNankaiUniversity實(shí)驗(yàn)步驟34編輯版ppt123autoradiographAnalyzebySDSLane1.MarkerLane2.GST-proteinXLane3.GSTGSTGSTProteinXProteinBiochemistryLabNankaiUniversity實(shí)驗(yàn)步驟35編輯版pptprepareproteinextractfrombrainmixandincubateexpressGST-fusionproteininE.colipGEXGSTgeneXProteinBiochemistryLabNankaiUniversity36編輯版pptProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGST-fusionproteinGSTalone37編輯版pptGSTpulldown驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用舉例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFPX-GFP+++GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFPProteinBiochemistryLabNankaiUniversity38編輯版ppt報告基因系統(tǒng)39編輯版pptgene；luciferase；greenfluorescentprotein報告基因(reportgene)是指一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因融合表達(dá)后，可通過報告基因產(chǎn)物的表達(dá)來“報告”目的基因的表達(dá)調(diào)控。這項(xiàng)技術(shù)靈敏度高、檢測簡便可靠、適于大規(guī)模生產(chǎn)，因而在監(jiān)測細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)和藥物篩選等方面得到廣泛應(yīng)用。一般的報告基因需要滿足以下幾個條件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；(3)表達(dá)產(chǎn)物易被檢測；(4)報告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形圍，以便分析啟動子活性的幅度變化?；(5)報告基因在細(xì)胞或動物內(nèi)表達(dá)對其正常的生理作用或活性沒有影響?，F(xiàn)主要以目前應(yīng)用最廣泛的報告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白為例，綜述報告基因的新近應(yīng)用研究進(jìn)展。1熒光素酶(1uciferase，luc)luc是能催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。根據(jù)來源不同主要分為細(xì)菌熒光素酶(bacterialluciferase，BL)、螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase，F(xiàn)L)以及以海星、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。

40編輯版ppt報告基因的研究背景

要研究基因的功能，基因的調(diào)控機(jī)制非常重要，基因的表達(dá)產(chǎn)物很復(fù)雜并難以準(zhǔn)確的定量和定性。研究報告基因系統(tǒng)成為一種簡單的研究基因調(diào)控的方法。對真核基因調(diào)控的了解，主要來自野生型和突變型的假定順式作用調(diào)控元件的活性測定實(shí)驗(yàn)，是在轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中進(jìn)行的。在大多數(shù)情況下不直接測定調(diào)控元件的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力,而是把順式調(diào)控元件與一種編碼新的產(chǎn)物的,被稱為報告基因的基因序列連接起來,在基因的轉(zhuǎn)錄過程中,測定報告基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量,來判斷順式調(diào)控元件的調(diào)控能力。41編輯版ppt一般的報告基因需要滿足以下幾個條件：基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好；細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測。報告基因的表達(dá)同樣也不能影響或改變細(xì)胞正常的生理活性。報告分子的分析結(jié)果應(yīng)具有很寬的線形圍，以便分析啟動子活性的幅度變化；報告基因在細(xì)胞或動物內(nèi)表達(dá)對其正常的生理作用或活性沒有影響。42編輯版ppt

報告基因通常是在報告基因載體質(zhì)粒中與被檢測基因序列相連,提取大腸桿菌中擴(kuò)增的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入目的真核細(xì)胞中。與此同時還要將一有真核啟動子和增強(qiáng)子的另一種報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞,以作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對照。目前已有很多的方法用于報告基因的測定如:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法及原位染色法及流式細(xì)胞儀法。43編輯版ppt

報告基因的種類氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報告基因(chlormnphenicolacetyltransferase,CAT)

細(xì)菌的CAT酶能將乙?；鶑囊阴］o酶Ａ轉(zhuǎn)移到氯霉素上,而使其失去抗菌性。該反應(yīng)能通過測量放射性標(biāo)記的底物而量化。放射性同位素標(biāo)記底物有3Ｈ標(biāo)記的乙酰輔酶Ａ和14Ｃ標(biāo)記的氯霉素或用熒光素標(biāo)記其中之一。CAT抗體可用于ELISA法檢測CAT。

優(yōu)點(diǎn)：在真核細(xì)胞中的本底很低；結(jié)果的重現(xiàn)性很好；靈敏度很高。缺點(diǎn)：只能用細(xì)胞提取物進(jìn)行測定；測定的范圍很窄；可能有放射性同位素的污染。

44編輯版pptβ

半乳糖苷酶報告基因(βgalatosidase,βgal)

大腸桿菌編碼的βgal能水解乳糖為半乳糖。雖然在很多細(xì)菌、植物和動物細(xì)胞中存在較高的本底,而限制了它的使用,但常用做轉(zhuǎn)染的參照體系。通過使用特定的方法,還能夠區(qū)別內(nèi)外源性的βgal(改變緩沖液的ｐＨ等)檢測方法:比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、FACS等。45編輯版pptβ

葡萄糖苷酸酶(βglucuronidase,βGUS)報告基因

是大腸桿菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。主要用于缺乏該酶的病毒性植物病原體、植物、酵母、及真菌等的研究中,在醫(yī)學(xué)研究中相對應(yīng)用較少。

相關(guān)產(chǎn)品

ICN公司的AuroraGUS試劑盒，應(yīng)用了MUG(4methylumbelliferylβDglucuronide)使實(shí)驗(yàn)的靈敏度比同類的熒光分析更加靈敏，且能使存在動植物細(xì)胞中的熒光本底降低很多46編輯版ppt

分泌型堿性磷酸酶(Secretedalkalinephosphatase,SEAP)報告基因

該酶為人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的突變體,也有從北大西洋海域中的耐熱細(xì)菌中分離出耐熱型AP。

由于該酶能分泌到細(xì)胞外,在檢測時,可以在不破壞細(xì)胞的情況下,任意時間都可以取細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行重復(fù)的、動態(tài)的檢測,還可以用做其它的用途。

47編輯版ppt熒光素酶(luciferase,luc)報告基因該酶克隆于北美洲螢火蟲的熒光素酶基因,它能催化甲蟲的熒光素的氧化性羧化作用,發(fā)射出光子,能被光度計(jì)或閃爍計(jì)數(shù)器捕獲定量?？焖佟⒎奖?更具有很好的濃度線性范圍(具有7～8個數(shù)量級的線性范圍),而被廣泛應(yīng)用。能在合成時與蛋白產(chǎn)生融合蛋白,該酶的檢測靈敏度達(dá)10-20

mol,且該酶的半衰期很短,在評價基因的表達(dá)物的誘導(dǎo)效應(yīng)的瞬間分析中具有較好的效果。在化學(xué)反應(yīng)中通過降低反饋抑制而使信號更加穩(wěn)定,使其檢測可以用液閃法或光照度計(jì)法進(jìn)行檢測。48編輯版ppt綠色熒光蛋白(GFP）報告基因

該基因來源于西北太平洋海域的水母。該蛋白在紫外光下發(fā)射熒光,而可以被多種方法檢測。該報告基因檢測不需要底物。綠熒光蛋白在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活?？捎脽晒怙@微鏡或熒光激活的FACS進(jìn)行檢測,能在活細(xì)胞條件下觀測,而且能進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的定位分析。能在轉(zhuǎn)基因小鼠中以無害的形式整合于小鼠的DNA中。49編輯版ppt報告基因的應(yīng)用啟動子活性分析基因轉(zhuǎn)移分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性檢測受體功能鑒定細(xì)胞毒性檢測生物大分子的相互作用藥物開發(fā)的生物篩選50編輯版ppt蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽

(PTDs)51編輯版ppt細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽

◆概念一些蛋白質(zhì)如HIV的TAT蛋白、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp、HBV的前S抗原等可以進(jìn)入細(xì)胞。其特定結(jié)構(gòu)域（一般10-30個氨基酸）對其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮主要作用。如果將這一結(jié)構(gòu)域可以攜帶生物大分子以非受體依賴方式進(jìn)入細(xì)胞。這些具有攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽統(tǒng)稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（Transductionpeptide）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能區(qū)（proteintransductiondomain,PTD）。52編輯版ppt◆病毒蛋白TAT和VP22從感染細(xì)胞到非感染細(xì)胞的擴(kuò)散。◆蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能作用機(jī)制：非受體特異性的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。經(jīng)典的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：受體運(yùn)輸小體內(nèi)涵體（或胞飲作用）蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)：富含精氨酸和賴氨酸的蛋白結(jié)構(gòu)易于和帶負(fù)電的磷脂膜結(jié)合。轉(zhuǎn)導(dǎo)的非折疊構(gòu)象進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)重新再折疊。

53編輯版ppt◆三種主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)：HIV-1TAT,HSVVP22,AntpAntp所能結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的蛋白大于100氨基酸；

TAT,VP22可攜帶大于1000個氨基酸54編輯版ppt蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的三種產(chǎn)生途徑■蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中肽段的人工合成：并且與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽段可交聯(lián)成大蛋白?！鲛D(zhuǎn)染TAT或VP22的表達(dá)載體于細(xì)胞中，融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)，在由原始的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌而進(jìn)入周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞?！鯰AT融合蛋白在細(xì)菌中大量表達(dá)，分離純化后加到培養(yǎng)液中。55編輯版ppt

TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

(A)構(gòu)建原核