用鹽酸胍裂解細(xì)胞教學(xué)課件

核酸的制備及基因組文庫的構(gòu)建朱德裕主要內(nèi)容、核酸制備的基本原理核酸制備的基本方法三、質(zhì)粒DNA的制備四、基因組DNA的制備五、RMA的制備六、基因組、cDNA文庫的構(gòu)建、核酸制備的基本原理DNA主要存于細(xì)胞核中,其它如線粒體和質(zhì)體等,也含有少量DNARNA主要存于細(xì)胞質(zhì)中,其它如線粒體和核仁等也含有RNA。在生物體中,DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存核酸不溶于一般有機(jī)溶劑。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞EukaryoteDNAProkaryoteDNAorganizedinasingleNucleuschromosomeNonucleusNomitosisDNAorganizedinmultiplechromosomesinsideanucleusMitoticdivision類別原核細(xì)胞真核細(xì)胞細(xì)胞大小較小無成形的細(xì)胞核,有成形的真正的細(xì)細(xì)胞核無核膜,無核仁,胞核,有核膜、核無染色體仁和染色體有核糖體有核糖體、線粒體等,植物細(xì)胞還有細(xì)胞質(zhì)(唯一的細(xì)胞器)葉綠體和液泡等(有多種細(xì)胞器)生物類群細(xì)菌、藍(lán)藻、放線菌植物、動物、真菌原核細(xì)胞簡示圖細(xì)菌的基本構(gòu)造菌毛細(xì)胞質(zhì)原核細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜露的DNA雙鏈所構(gòu)成的擬核。擬擬核核沒有與細(xì)胞質(zhì)部分相隔開的界膜(核膜),這是與真核細(xì)胞的莢膜主要區(qū)別細(xì)胞壁細(xì)胞膜真核細(xì)胞中只有植物細(xì)胞有細(xì)胞壁核糖體鞭毛原核細(xì)胞中的DNA沒有組蛋白(histone)與之結(jié)合。無有絲分裂(mitosis和減數(shù)分裂(meIosIs,DNA復(fù)制后,細(xì)胞隨即分裂為真核細(xì)胞簡示圖真核細(xì)胞含有細(xì)胞核。核糖體DNA與組蛋白等蛋白質(zhì)共同組成染色體結(jié)構(gòu),相胞枝浴酶在核內(nèi)可看到核仁。真核生物進(jìn)行有性繁殖,并進(jìn)行有絲分裂。也有些真核生物的細(xì)胞也能進(jìn)行無絲分裂,如人的體肝臟細(xì)胞高爾基體核酸制備的基本原理1、細(xì)胞破碎2、將核蛋白解聯(lián),即利用解聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白。3、精致純化核酸注意事項(xiàng):操作過程應(yīng)避免核酸的降解,包括化學(xué)因素(如過酸過堿),物理因素(如強(qiáng)烈振蕩、高溫、輻射等),生物酶等、核酸制備的基本方法(一)細(xì)胞破碎1、物理方法機(jī)械碾碎:對于動物組織(如鼠肝),一般多采用勻漿的方法。組織搗碎器:是一種劇烈的破碎的方法,必須保持低溫,時間不宜太長超聲波:借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。壓榨法:是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小于細(xì)胞直徑的小孔,使細(xì)胞被擠壓破碎。2、溶脹和自溶溶脹:在低滲溶液(如低濃度的稀鹽溶液中),由于存在滲透壓差,溶劑分子將大量進(jìn)入細(xì)胞,致使細(xì)胞膜膨脹破裂。自溶:細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下,發(fā)生溶解。應(yīng)用此法要特別小心,防止目的核酸被分解3、化學(xué)處理用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表明活性劑SDS)處理細(xì)胞時,可使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解,導(dǎo)致細(xì)胞破碎。生物酶降解如溶菌酶等生物酶有降解細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時,先是細(xì)胞壁消融,然后是滲透壓引起的細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞破碎各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母4超聲法細(xì)胞混