第17章-體內(nèi)藥物分析簡介課件

第十七章體內(nèi)藥物分析簡介第一節(jié)概述

一、體內(nèi)藥物分析的性質(zhì)

體內(nèi)藥物分析（生物藥物分析）是藥物分析的重要分枝，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來的綜合性的應(yīng)用學(xué)科。體內(nèi)藥物分析——研究藥物在體內(nèi)的“命運”通過分析手段了解藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得藥物動力學(xué)參數(shù)和代謝的方式、排泄的途徑等信息，為臨床藥學(xué)研究提供必要的數(shù)據(jù)和相關(guān)信息,有助于藥物生產(chǎn)、研究、臨床應(yīng)用等方面對藥物作出估計與評價。如果沒有體內(nèi)藥物分析提供的數(shù)據(jù)和相關(guān)信息，進(jìn)行臨床藥學(xué)研究是不可想象的。體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的在體內(nèi)質(zhì)與量變化規(guī)律的分析方法學(xué)意義：（一）新藥評價和開發(fā)中的意義（二）臨床合理用藥中的意義（三）藥物作用機制探討藥物質(zhì)量評價的安全性、有效性（四）代謝分型研究中應(yīng)用三、體內(nèi)藥物分析的對象和任務(wù)分析物：主要生物樣品中的藥物、體內(nèi)代謝物、活性的代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)生物樣品對象:人體和實驗動物生物樣品種類:體液（血液、尿液、唾液），另外還有頭發(fā)和器官組織等。體內(nèi)藥物分析的任務(wù)1.分析方法學(xué)的研究和完善

提供靈敏、專屬、準(zhǔn)確的分析方法與最佳分析條件

2.為藥物體內(nèi)研究提供數(shù)據(jù)提供藥物在動物和人體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù)3.為臨床治療藥物監(jiān)測提供準(zhǔn)確的血藥濃度測定值—提供藥學(xué)情報和信息,參與臨床科學(xué)用藥,確定最佳劑量,制定治療方案.4.體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測定和研究氨基酸、激素、肌酐、草酸、尿酸等在體內(nèi)一定濃度范圍內(nèi)含量變化指示機體病變—為某些疾病的診斷及治療提供重要信息5.濫用藥物的檢測—為吸毒者體內(nèi)毒品和運動員體內(nèi)禁藥的測定提供分析方法和可靠數(shù)據(jù).

體內(nèi)藥物分析的特點與要求一、體內(nèi)藥物分析的特點1．干擾物質(zhì)多2．樣品量少、不能重復(fù)取樣3．被測成分濃度低,對分析方法的靈敏度和專屬性要求較高.4．有時需要測定綴合物和代謝產(chǎn)物.5.供藥物濃度監(jiān)測的分析方法要求簡便、快速６.工作量大，要有一定的儀器設(shè)備二、分析方法的新要求1.

檢測方法的高靈敏度（最低檢測量10-9~10-7g甚至10-15~10-12g）2.

分離方法的高選擇性、高專屬性3.

分析方法應(yīng)達(dá)到要求的精密度、準(zhǔn)確度,具有穩(wěn)定且較高的回收率4.

求解出實驗與臨床上有意義的參數(shù)體內(nèi)藥物分析的發(fā)展概況

及熱點問題

一、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展概況20世紀(jì)60年代—臨床藥理學(xué)與生物藥劑學(xué)的建立70年代初—體內(nèi)藥物分析在國外開始建70年代末—血藥濃度監(jiān)測廣泛用于臨床80年代—體內(nèi)藥物分析學(xué)科日趨成熟90年代—微量、超微量分離、分析技術(shù)應(yīng)用

第二節(jié)生物樣品的種類、采集和制備

生物樣品種類臟器組織：體液：血液、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等最常用的生物樣本

尿液—用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測定唾液—用于某些S/P較為恒定的藥物的測定

毛發(fā)—可用于藥物濫用監(jiān)測及微量元素測定肝、胃、腎、肺、腦等臟器組織

—動物試驗研究藥物吸收、分布狀態(tài)及服藥過量中毒死亡1.血樣的采集一般用注射器直接采集靜脈血，每次1~5ml；動物實驗時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一

注：測定血中藥物的濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血血漿的制備采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500~3000r/min離心5~10min使與血球分離，所得淡黃色上清液即為血漿（plasma）

血清的制備

采集的靜脈血液置試管中，于37℃或室溫放置30min~1h。血液凝固后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难?，再?500~3000r/min離心5~10min，上層淡黃色液體即為血清（serum）

血清比血漿只是少一種纖維蛋白原

C血漿=C血清血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的20%~40%），多數(shù)用血漿進(jìn)行分析。若血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應(yīng)使用血清樣品

全血的制備成分：血漿有形物質(zhì)：紅細(xì)胞白細(xì)胞血小板全血的制備將采集的血液置含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞均相狀態(tài)，即為“全血”（wholeblood）

某些情況血漿內(nèi)藥物濃度波動大，或血漿濃度低，可用全血（全血凈化較血漿和血清麻煩）血漿和紅細(xì)胞中分配比不是常數(shù)，則應(yīng)使用全血樣品

血樣主要應(yīng)用于：

藥物動力學(xué)

生物利用度

臨床治療藥物濃度監(jiān)測（二）尿液(urine)

尿液用于：藥物劑量回收、藥物尿清除率、生物利用度的研究，預(yù)測藥物代謝過程、類型體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等多種形式排出性狀—淡黃色或黃褐色，相對密度1.105~1.020，pH4.8~8.0成分—水、含氮化合物、鹽類等微生物—防腐劑尿液的采集

樣本來源—自然排尿，成人一日排尿量為1~5L（隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿）

樣本采集—一般采集時間尿（規(guī)定時間內(nèi)采集尿液體積和排入尿中的藥物總量（三）唾液（saliva）

唾液—無損傷取樣，易收集；一些藥物的唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此： —TDM中利用對S的測定代替對P的監(jiān)測 —藥代動力學(xué)的研究唾液采集

在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)

唾液樣品采集后，應(yīng)立即測量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保存 生物樣品的貯存與處理冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)

冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)中長期保存注：冷藏或冷凍時限經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定血樣：采集后及時分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存—若不予先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時易引起細(xì)胞溶解，會阻礙血漿或血清的分離—置硬質(zhì)玻璃試管中完全密塞后保存尿樣

采集后應(yīng)立即測定，若不能立即測定，加入防腐劑后保存 常用防腐劑：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、濃鹽酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改變尿液酸堿性抑制細(xì)菌的生長 保存時間為24~36h(4℃)或長期(-20℃)唾液

為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4℃以下保存 —保存過程中放出二氧化碳而使pH升高，測定唾液pH時應(yīng)在取樣的當(dāng)時為好—冷凍保存唾液時，解凍后有必要將容器內(nèi)唾液充分?jǐn)噭蚝笤儆?，否則測定結(jié)果會產(chǎn)生誤差

第三節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備樣品預(yù)處理技術(shù)

分離、純化、富集或化學(xué)衍生化等，為藥物的最終測定創(chuàng)造良好的條件

樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)；也是分析中最困難、最繁雜的工作

——對于生物樣品的預(yù)處理很難規(guī)定固定的程序和方式，必須結(jié)合測定實際和要求，采取恰當(dāng)?shù)姆椒ê图夹g(shù)一、生物樣品預(yù)處理的目的

使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

——定藥物的總濃度使樣品純化——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 提高檢測靈敏度——適應(yīng)和符合測定方法要求的靈敏度 防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果二、方法的選擇

待測生物樣品的類型決定樣品預(yù)處理方法：

血漿、血清——常需去除蛋白質(zhì) 唾液——主要采用離心沉淀除去粘蛋白 尿液——常采用酸或酶法使綴合物水解 頭發(fā)——需要將頭發(fā)進(jìn)行有機破壞后測定微量元素1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式酸堿性(pKa)、溶解性——提取性質(zhì)揮發(fā)性——揮發(fā)損失及氣相色譜法的應(yīng)用光譜特性——分析儀器的選擇官能團性質(zhì)——化學(xué)衍生化和檢測器應(yīng)用化學(xué)穩(wěn)定性——處理條件的選擇存在形式及血漿蛋白結(jié)合率——預(yù)處理方法

2.待測藥物的濃度范圍不同藥物在體內(nèi)中濃度相差極為懸殊

——地高辛治療血濃為1~2ng/ml ——水楊酸鹽治療血濃為20~100g/ml 濃度大——預(yù)處理要求稍低 濃度低——樣品制備要求高3.藥物測定目的藥物測定目的不同——樣品預(yù)處理的要求不同： 急性中毒病例——要求快速鑒定所懷疑的藥物，應(yīng)在盡可能短的時間內(nèi)獲得其濃度的數(shù)據(jù)，對樣品預(yù)處理的要求可以粗放些

測定藥物及代謝物——要求使代謝物從綴合物中釋放出來并在不同pH介質(zhì)中分離獲得酸性、中性或堿性代謝物，對樣品預(yù)處理的要求全面、細(xì)致5.樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系

1.分析方法特點(是否專屬、是否具有分離能力)2.檢測系統(tǒng)對雜質(zhì)污染的耐受程度決定樣品預(yù)處理和需要凈化的程度三、生物樣品的預(yù)處理與制備技術(shù)

（一）有機破壞法

應(yīng)用——微量元素測定方法

1．濕法破壞 2．干法破壞 3．氧瓶燃燒法1.濕法破壞

常用試劑—硝酸或硝酸-高氯酸

特點—破壞能力強、反應(yīng)激烈，無機金屬離子為高價態(tài)

應(yīng)用—適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞

缺點—含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全注意—切勿蒸干、以免爆炸樣品用量—金屬元素量10~100g，血樣10~15ml、尿樣50ml2、干法破壞高溫爐高溫破壞應(yīng)用——適合人發(fā)樣品的破壞3.氧瓶燃燒（oxygenflaskcombustion）

特點——操作簡單、快速、設(shè)備簡單 應(yīng)用——血漿、人發(fā)中鹵素、硫、硒等

血漿：血漿1ml分次點于無灰濾紙上→60℃烘干→按規(guī)定折疊后固定 人發(fā)：洗凈、干燥（60℃~80℃）→剪碎→稱取0.1~0.3g置無灰濾紙中心→按規(guī)定折疊固定

（二）去除蛋白質(zhì)非破壞性生物樣品預(yù)處理的第一步可使結(jié)合型藥物釋放

1.去除蛋白后取上清液直接分析測定2.去除蛋白后取上清液經(jīng)進(jìn)一步分離純化、濃集后分析測定去除蛋白質(zhì)的方法

1.加入與水混溶的有機溶劑—蛋白質(zhì)脫水沉淀2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)3.加入強酸—與蛋白質(zhì)陽離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀4.加入重金屬鹽—與蛋白質(zhì)陰離子(羧基)形成不溶性鹽沉淀5.超濾法—半透膜濾除可溶性生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)7.加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固1.加入與水相混溶的有機溶劑

常用有機溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃血樣與溶劑體積比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白

乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成分損失可能性大，上清液pH為8.5~9.5甲醇—細(xì)小顆粒沉淀、不易分離；成分損失可能性小，上清液pH為8.5~9.5超速離心分離（12000r/min)—離心1~2min

2.加入中性鹽常用中性鹽—飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等試劑用量—血清與飽和硫酸銨比例為1∶2時除去90%以上的蛋白質(zhì)分離—高速(12000r/min)離心上清液pH7.0~7.73.加入強酸常用的強酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等試劑用量——血清與強酸比例為1∶0.6時，除去90%以上的蛋白質(zhì)分離——高速(12000r/min)離心1~2min，上清液pH0~4過量三氯醋酸——煮沸分解為氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀4.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑

當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基與金屬陽離子形成不溶性鹽沉淀 常用沉淀劑—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH血清與沉淀劑比例—1∶(1~3)， 分離—高速(10000r/min)離心，上清液pH分別為5.7~7.3和6.5~7.55.超濾法性質(zhì)—以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)；特點—無需加熱；無需添加化學(xué)試劑；無相變化；無破壞性應(yīng)用—游離藥物首選方法

操作—分子量截留值在5萬左右的超濾膜過濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了的藥物的血漿蛋白分離

6．酶水解法

加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，過濾或離心，取上清液供萃取用 最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在較寬的pH范圍(pH7.0~11.0)內(nèi)使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力7.

加熱法

測定對熱穩(wěn)定性好的組分時，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀 加熱溫度視欲測組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜岬?0℃；蛋白沉淀后可用離心或過濾除去 優(yōu)點——方法最簡單 缺點——只能除去熱變性蛋白（三）溶劑提取溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)—相似相溶的原則②對藥物未電離分子可溶，電離形式分子不溶③沸點低、易揮散，毒性小與水不相混溶④不影響紫外檢測⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性有機溶劑萃取次數(shù)—通常為1次，必要時2~3次有機溶劑每次用量—與水相體積比通常為1:1或2~5:1通過萃取回收率確定最佳萃取次數(shù)與每次的溶劑用量水相pH值:

由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值高于pKa值1~2個pH單位酸性藥物最佳pH值：低于pKa值1~2個pH單位一般規(guī)則：堿性藥物在堿性pH值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)中提取

生物樣品宜在堿性或近中性提取，生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取?？瞻籽逶趐H2、pH7和pH13緩沖液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)測定，堿性藥物在pH13下提取液雜質(zhì)峰少

提取技術(shù)：提取次數(shù)：提取時通常不采用反復(fù)提取的方法，多半進(jìn)行一次（至多二次）提取，在改變pH后，從有機相回提至水相也只進(jìn)行一次。內(nèi)標(biāo)的加入：為避免進(jìn)樣時帶來的誤差，多采用提取前加入等量內(nèi)標(biāo)，以待測組分峰高（或峰面積）與內(nèi)標(biāo)峰高（或峰面積）之比對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，即使在一系列操作過程中有微量損失，對比值影響也較小?；旌希嚎稍诿苋闆r下將試管平置于振蕩器內(nèi)振蕩，振蕩時間與強度視情況而定?？刹捎靡浴八幬镛D(zhuǎn)入溶劑中量”與“混合時間”作圖法，選取理想和符合實際的提取方式和時間。提取溶劑的蒸發(fā)：常用真空蒸發(fā)（注意暴沸）或吹氮氣流使溶劑揮散。（四）

固相萃?。⊿olid-phaseextraction,SPE）

原理

將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。固相的選擇原則：固相與被測組分應(yīng)具有相似的極性①親脂型（大孔吸附樹脂、親脂性鍵合相硅膠）②親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）③離子交換型固相萃取法實驗步驟

第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料第二步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱—除去殘留的甲醇第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液第四步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除內(nèi)源性雜質(zhì)第五步：選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫?，收集洗脫液，揮干溶劑，備用或直進(jìn)行在線分析第四節(jié)樣品的玷污與損失一、樣品沾污：（一）增塑劑(Plasticizers)：測定發(fā)現(xiàn)某些塑料血樣采集管含有3-(2-丁羥乙基)磷酸酯等，可使溶劑提取步驟中藥物分配系數(shù)變化、方法變異系數(shù)增大（從5%增至20%）。（二）脂肪酸及酯類：血樣中濃度約為350μg/ml（10-3mol/L），較待測藥物高102～103倍以上,易被提入。常出現(xiàn)在色譜圖中。

（三）溶劑中雜質(zhì)：由于溶劑體積其它試劑為大，即使原來雜質(zhì)濃度較低，濃集時或通過色譜柱時，濃度顯著增大而干擾測定。更嚴(yán)重的是干擾物在每批溶劑或試劑中有所不同，而影響不同實驗室間、各分析人員間的實驗結(jié)果。解決辦法是采用高純度溶劑（價貴）、有時在使用前重新應(yīng)用全玻璃儀器重蒸餾。其次是采用專屬的檢測方法。

（四）化學(xué)衍生化帶來的雜質(zhì)：由于試劑未經(jīng)純化致使色譜分析中往往呈現(xiàn)額外的雜質(zhì)峰。（五）實驗環(huán)境和器皿、材料的污染：實驗室的去污劑、潤滑油、濾紙、玻璃器皿不夠潔凈，蒸餾水純度不夠等。二、導(dǎo)致待測物損失的因素：

（一）吸附與共沉淀：玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特別是脂肪胺類及含硫化合物?？刹捎霉柰榛瘻p少玻璃表面的吸附性，非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少器皿對藥物的吸附。血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形成，常能引起待測物的共沉淀。所以宜將全血樣品加入緩沖液后再行提取。這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少共沉淀的損失。緩沖液的一定離子強度，可蛋白質(zhì)變性時形成疏松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉淀的損失。

（二）化學(xué)降解：藥物的化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定性常引起化學(xué)分解；光化學(xué)及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應(yīng)加注意。應(yīng)盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的藥物尚需避光操作。

（三）衍生化反應(yīng)：

由于不完全反應(yīng)，待測藥物僅部分轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物或形成副產(chǎn)物。有時在蒸發(fā)除去過量衍生化試劑時，使得衍生物與溶劑形成共沸混合物而導(dǎo)致?lián)p失。（四）絡(luò)合：

某些藥物會與重金屬離子絡(luò)合或與內(nèi)源必性大分子相互作用，這種情況雖較少遇到，但往往是某些樣品制備中藥物損失的一個因素。

（五）蒸發(fā)：

有的是藥物本身的揮發(fā)性（如苯丙胺）或因蒸發(fā)所得殘渣未能完全溶于所加的小體積溶劑中；或因減壓濃縮引起溶液暴沸而導(dǎo)致?lián)p失；或在吹氮過程中使藥物以氣溶膠形式逸出。

第五節(jié)體內(nèi)藥物分析常用

分析方法一、常用分析方法的特點分析方法檢測限度/10-9g特異性/分離能力紫外分光光度法（UV）100－熒光分光光度法（Fluor）1±原子吸收光度法（AA）1+薄層掃描法（TLSC）

紫外檢測器（UV）

10++

熒光檢測器（Fluor）1++氣相色譜法（GC）

氫火焰離子化檢測器（FID）1～10++

氮磷檢測器（N-PD）0.1～0.01+++

電子捕獲檢測器（ECD）0.01+++

質(zhì)量碎片選擇離子檢測器（MS）0.01++++高效液相色譜法（HPLC）

紫外檢測器（UV）1++

熒光檢測器（Fluor）0.1+++

電化學(xué)檢測器（ECD）0.01～0.001+++免疫法（IA）放射免疫法（RIA）0.01++

酶免疫法（EIA）0.01++

熒光免疫法（FIA）0.01++二、分析方法的設(shè)計依據(jù)及建立分析檢測方法的主要依據(jù)待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況分析測定的目的與要求生物樣品的類型與樣品制備方法實驗室條件1、待測藥物的理化性質(zhì)萃取方法和萃取條件的選擇親脂性、藥物的pKa值、水和有機溶劑中的溶解度及分配系數(shù)

親脂性——在適當(dāng)?shù)膒H值下用有機溶劑萃取強極性或親水性——沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等揮發(fā)性——極性小有機溶劑萃取藥物穩(wěn)定性——萃取濃縮技術(shù) 對酸堿不穩(wěn)定——避免使用強酸或強堿性溶劑對熱不穩(wěn)定——避免高溫蒸發(fā)溶劑對光不穩(wěn)定——避光操作2、待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)

與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低 ——分離萃取方法蛋白結(jié)合較強不宜直接采用溶劑萃取

體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物 ——分析檢測技術(shù)3、分析測定的目的與要求（1）藥代動力學(xué)研究 要求——同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物 檢測——寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性 方法——不必強調(diào)方法的簡便、快速；重點考慮測定濃度范圍較寬——多采用HPLC、GC-MS、LC-MS（2）臨床治療藥物監(jiān)測

測定有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度分析方法盡量簡便易行、快速，適用于長期、批量樣——大多采用UV、RIA或EIA等（3）中毒患者的臨床搶救

藥物濃度極高不必強調(diào)方法的靈敏度，特別強調(diào)方法特異性，速度快——大多采用GC、GC-MS、RIA或EIA4、樣品類型與預(yù)處理方法與分析方法相關(guān)以血漿或血清為分析樣品，采用蛋白沉淀-溶劑萃取預(yù)處理技術(shù)，樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測 RIA分析樣品的預(yù)處理方法可較為粗放，經(jīng)簡單蛋白沉淀或不經(jīng)預(yù)處理直接測定5、實驗室條件 實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。三、分析方法建立的一般步驟（一）、分析方法的選擇（二）、分析方法的建立1、

檢測條件的篩選 2分離條件的篩選方法的選擇：生物樣品中藥物濃度——決定分析方法的首要因素方法的建立： 分析方法的建立——大量試驗工作，選擇最佳分析條件分析方法的驗證——分析方法的建立與分析方法的驗證緊密相關(guān)步驟：第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選檢測條件：以待測藥物對照品照擬定的分析方法（預(yù)處理除外）測定。根據(jù)測定結(jié)果確定最佳分析檢測條件例：HPLC——檢測器、色譜柱、流動相、柱溫、內(nèi)標(biāo);使具有足夠的方法靈敏度、良好的色譜參數(shù)(n、R、T)、適當(dāng)保留時間(tR）分離條件：在進(jìn)行分離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾以對照品確定的檢測條件確認(rèn)是否適用于實際生物樣品 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例