單抗中常見問題解析

為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？答：可以從這幾個方面一一考慮：設(shè)計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種狀況應(yīng)當重設(shè)計抗原，設(shè)計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，假設(shè)偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是全部載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可50%的偏差。免疫佐劑不適宜。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嘗試。免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推舉的劑量不要相差兩倍以上。免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內(nèi)免疫方法，具體操作本站上也有具體的講解。測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗〔即血清〕稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：5001：1000開頭作梯度稀釋。對于小1：2023仍可視為免疫成功。為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？答：可以從這幾個方面考慮：免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)當與骨髓瘤來源的動物SP2/0Balb/C小鼠，同時必需使用品系純粹的小鼠。HATAHT的濃度過低，建議用純HAT濃度篩選。培育基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。未正確制備飼養(yǎng)層細胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細胞制備的部份。接種雜交瘤細胞的培育板過多。一般在5-2096孔板為宜。融合后，未準時轉(zhuǎn)移或稀釋細胞。有人在做融合后寵愛把融合的細胞先放在培育瓶中培育，然后再滴到96孔板上。假設(shè)在培育瓶中培育的時間過長，也可能消滅克隆利率少的狀況。細胞被污染。在顯微鏡下認真觀看是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)當考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。37CO2濃度在4-5%左右。其它與融合條件相關(guān)的不恰當?shù)囊蛩?。詳見本站有關(guān)細胞融合的部份。為什么融合后得不到陽性克??？答：可能的緣由：動物未免疫成功就進展了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁2個問題。篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不行以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷?？乖煞菖c細胞培育條件中的物質(zhì)一樣或類似，或者與篩選過程中有同抗原構(gòu)造一樣或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反響。舉個簡潔的例子，假設(shè)需要制備抗BSA的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培育基中不行以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最終做ELISA篩選ELISAELISAELISA試驗的講解與爭論。為什么我的細胞生長很慢？答：可能的緣由：HATHT。建議手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進展試驗。在細胞的倍增速度確實血清質(zhì)量。使用的血清或培育基濃度不正確。認真檢查配方是否正確。制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面其次個問題。其它問題，可以參考本頁面其次個問題。我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？加以留意：永久保證細胞處在最正確的生長環(huán)境中。尤其是培育基不能長期不換，一般來說，當細消耗。對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。不要過于頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞簡潔消滅死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。對于傳代次數(shù)較多的細胞株需要常常進展亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。當細胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的狀況。為什么我做亞克隆后長不出克隆來？答：亞克隆失敗的緣由和克隆不長的緣由類似，但是除此之外，也還有一些獨特的緣由?！?〕亞克隆時，原始孔里的細胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆?！?)亞克隆時，沒有依據(jù)正確的數(shù)量取出細胞，在本站有關(guān)亞克隆操作的頁面上提到過，亞于平均每孔一個細胞，則也可能消滅長不出克隆的結(jié)果。未添加飼養(yǎng)層細胞。單個細胞在完全培育基中極難培育，假設(shè)不添加飼養(yǎng)層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。使用的HATHT失效或A的濃度過高，或者未添加HTHT對雜交瘤的生長并HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態(tài)。使用無血清培育基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培育基制的解決方法就是先用含有血清的培育基培育它們清培育基。為什么我凍存的細胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？答：這個問題要從兩個方面來答復(fù)，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。對于凍存過程，需要留意：凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得格外好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡10%DMSO+90%DMSO的含量對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來依據(jù)說明書操作就OK了。凍存過程中，不行用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，由于在DMSO就明顯會下降。凍存的程序也格外重要。實踐說明，以每分鐘1℃的速度下降凍存細胞是最抱負的。4-201-2小時，最終轉(zhuǎn)入-80-80℃也行?，F(xiàn)在市場上有-80℃就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很簡潔進入凍存管。這入凍存管，最終可能造成細胞污染。保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。對于復(fù)蘇過程，需要留意：快速。為了防止升溫中細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，猛烈建議加快溶化過程。一般都要用用足夠37℃熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。，造成復(fù)蘇的細胞被污染。有的人復(fù)蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了的培育體全培育基重懸，再接種到的容器內(nèi)培育。為什么我的細胞總是污染？如何可以救活污染的細胞？答：養(yǎng)細胞消滅污染，幾乎是每個細胞培育技術(shù)員簡潔消滅的問題。要防止細胞污染些根本的學問這里就不再廢話了。下面講一講如何挽救一株已經(jīng)被污染的細胞株。體外用抗生素消滅。一般來說，一旦覺察細胞被微生物污染，應(yīng)當馬上進展處理，也許還有一線挽救的時機。但是這種挽救不是盲目的，首先應(yīng)當決斷是哪一類生物造成的污染。細胞的污染大致可以分三類：細菌污染、真菌污染和支原體污染。在顯微鏡下認真觀看，微鏡下觀看有典型的斑狀或絲狀微生物〔留意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區(qū)分開，根本上看微生物。對于細菌污染，可以把青霉素的濃度提高至10倍左右，鏈霉素濃度提高至5-10倍，也可以用105ug/ml的咪康唑〔注射用達克寧〕抑制。對于這兩種狀況的污染，承受上述方法處理后，待細胞稍有好轉(zhuǎn)，并且沒有覺察更大規(guī)模的污染時，需要盡快重復(fù)上面的處理步驟。需要留意亞克隆操作，以獲得更加純潔的細胞株。而對于支原體污染，則比較麻煩，一般的抗生素是60ug/ml的泰樂菌素和10ug/ml左右的環(huán)丙沙株，假設(shè)此方法無效，則不能單純利用抗生素來解決污染問題。體內(nèi)法。這個方法很簡潔，原理就是動物體有強大的免疫系統(tǒng)，一般的微生物都可以被動物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣，即先用IFA或石蠟制敏小鼠，數(shù)天后采摘，然后放回培育板或培育瓶等容器內(nèi)培育。假設(shè)被污染的細胞很少，比方說在96孔板免疫系統(tǒng)攻擊而死亡的，最好的方法是承受脾內(nèi)注射的方法進展，同時在腹腔內(nèi)用IFA或石蠟油致敏，十幾天后，同樣可以形成腹水，其中即含有干凈的雜交瘤細胞。假設(shè)擔憂小鼠鼠體內(nèi)。假設(shè)確定細胞污染極其嚴峻，并且細胞已大面積死亡，建議放棄，快速做好環(huán)境清潔工作，被污染。為什么我的雜交瘤細胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價？答：不能制備腹水的緣由大部份是人為的緣由：致敏不正確，例如使用了不正確的致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。雜交瘤的接種位置不正確，沒有打到腹腔，而是打到了皮下。接種的雜交瘤細胞數(shù)量太少或者細胞狀態(tài)不好。一般不應(yīng)少于10萬個細胞，建議在100萬個細胞左右為宜。制備腹水小鼠的種系與參與融合的細胞來源的動物種系相差太遠，以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反響將其殺死，建議更換小鼠品系重接種。對于腹水沒有效價，可能的緣由：制備腹水的雜交瘤極不穩(wěn)定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌力量或者打到腹腔內(nèi)就失去了分泌力量。致敏小鼠時承受了錯誤的致敏劑，如使用了弗氏完全佐劑，這時即使不打雜交瘤，小鼠也會產(chǎn)生腹水。〔3)瘤產(chǎn)生的抗體被小鼠的相關(guān)蛋白中和，這種狀況下，小鼠的身體可能會消滅明顯的特別。〔4〕檢測腹水效價的試驗方案有問題，或者腹水稀釋比過大。免疫失敗的可能緣由及應(yīng)實行的措施答：有時不能獲得滿足的抗血清，可從以下幾方面找緣由，并改進之。免疫動物的種屬及品系是否適宜，可考慮轉(zhuǎn)變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量?？乖|(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮轉(zhuǎn)變抗原分子的局部構(gòu)造，或改進提取方法。制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反響時間等多方面去考慮，并加以改進。所用的佐劑是否適宜，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否適宜。動物的飼養(yǎng)是否得當，如養(yǎng)分〔飼料、飲水、環(huán)境衛(wèi)生〔通風、采光、溫度〕是否符合要求，動物的安康狀況是否良好等。制備單克隆抗體影響因素、失敗緣由分析答：由于制備McAb的試驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不留意就會造成失污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦覺察要對每一批小牛血清和長期傳代培育的細胞系進展支原體的檢查施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以實行生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，取出分別雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。融合后雜交瘤不生長，在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮以下因素：PEG有毒性或作用時間過長。牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進展嚴格的篩選。骨髓瘤細胞污染了支原體。HAT有問題，主要是AHT含量缺乏。雜交瘤細胞不分泌抗體或停頓分泌抗體：融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HATA失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A免疫效果不好。對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞