流式細(xì)胞儀-教材課件

流式細(xì)胞儀1.流式細(xì)胞術(shù)概述

2.流式細(xì)胞儀概述3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)4.流式細(xì)胞儀軟件介紹目錄5.流式細(xì)胞儀其它1.流式細(xì)胞術(shù)概述1.流式細(xì)胞術(shù)概述流式細(xì)胞術(shù)定義流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)1.流式細(xì)胞術(shù)概述1.流式細(xì)胞術(shù)定義：流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM或FACS)：是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)新型的、發(fā)展迅速的生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù),它是集激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)以及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技細(xì)胞分析技術(shù)。1.流式細(xì)胞術(shù)概述2.流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史：1930年Caspersson和Thorell開始致力于細(xì)胞計(jì)數(shù)的研究；1934年Moldaven最早設(shè)想細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化，用光電儀記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞；1940年Coons提出結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白；1949年WallaceCoulter申請(qǐng)了在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法的專利；1950年Caspersson用顯微UV-VIS檢測(cè)細(xì)胞1953年Croslannd-Taylor應(yīng)用分層鞘流原理，成功設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)1972年Herzenberg研制出細(xì)胞分選器1975年Kohler等提出單克隆抗體技術(shù)，為細(xì)胞研究提供大量的特異免疫試劑大量廠家不斷生產(chǎn)流式細(xì)胞儀1.流式細(xì)胞術(shù)概述3.流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)：分析對(duì)象：?jiǎn)渭?xì)胞懸液或生物顆粒分析速度：快速，最高達(dá)上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/秒檢測(cè)參數(shù)：多參數(shù)（兩個(gè)散射光參數(shù)、多個(gè)熒光參數(shù)）可同時(shí)測(cè)定多種可溶性細(xì)胞成分：流式微球芯片技術(shù)（CytometricBeadsArray,CBA）檢測(cè)結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好先進(jìn)的細(xì)胞定量技術(shù)2.流式細(xì)胞儀概述2.流式細(xì)胞儀概述流式細(xì)胞儀定義流式細(xì)胞儀的發(fā)展史與商品化流式細(xì)胞儀的生產(chǎn)廠家流式細(xì)胞儀的分類BD公司、Beckman公司的分析儀及分選儀外觀2.流式細(xì)胞儀概述貝克曼庫(kù)爾特Gallios流式細(xì)胞儀2.流式細(xì)胞儀概述1.流式細(xì)胞儀定義：流式細(xì)胞儀(FlowCytometor,FCM)是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，對(duì)高速直線流動(dòng)的細(xì)胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器,主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù),計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。2.流式細(xì)胞儀概述2.流式細(xì)胞儀的發(fā)展史與商品化：1953年：Parker和Hutcheon描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流

式細(xì)胞儀的雛型；1969年：VanDillaFulwyler發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)；1970年：Phywe研制脈沖細(xì)胞光度計(jì)，備有熒光鏡的FCM，DNA定量；同年Kamensky發(fā)明白細(xì)胞分類流式細(xì)胞儀，激光光源，吖啶橙染色，測(cè)定淋巴、單核、中性粒C；1972年：LenHerzenberg等在斯坦福大學(xué)研制熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS），氬離子激光，標(biāo)志著流式細(xì)胞儀商品化時(shí)代到來(lái)；1973年：BectonDikinson(BD)公司投入市場(chǎng)，第一臺(tái)FACS-Ⅰ問世，其后20多年來(lái)不斷改進(jìn)完善產(chǎn)品，先后推出FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、FACSVantage、FACSDiva、FACSAria等；1975年：Kochler和Milstein提出單克隆抗體技術(shù)，為細(xì)胞研究中大量的特異性免疫試劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；鑒于商業(yè)儀器的發(fā)展;2.流式細(xì)胞儀概述1983年：Shapiro認(rèn)為多參數(shù)分析流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)。此后，流式細(xì)胞儀進(jìn)入一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)期；1994年：美國(guó)Cytomation公司推出高性能、高速分選裝置MoFlo，該機(jī)以出色的性能和創(chuàng)新設(shè)計(jì)理念，一經(jīng)推出即受到廣泛關(guān)注；2008年：美國(guó)BD公司推出Influx，在MoFlo基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了原位、立體分選。2.流式細(xì)胞儀概述4.流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠家：目流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠家主要有BD、BeckmanCoulter、Partec、Guava、UnionBiometrica、ABI、Amnis等等。美國(guó)BD、Beckman

Coulter和德國(guó)的Partec占領(lǐng)著流式細(xì)胞儀市場(chǎng)的統(tǒng)治地位。BD、BeckmanCoulter產(chǎn)品型號(hào)種類齊全，占市場(chǎng)份額較大，如：

經(jīng)濟(jì)普及型流式細(xì)胞儀：FACSCount、CytomicsFC500；

大型科研型流式細(xì)胞儀：BDFACSAria、EPICS；特點(diǎn)：產(chǎn)品價(jià)格昂貴，我國(guó)使用的單位基本上是科研機(jī)構(gòu)。Partec產(chǎn)品結(jié)構(gòu)緊湊，造價(jià)低，便于攜帶，適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家，在植物學(xué)的研究中占有較大份額。Partec公司的CyFlow于2004年1月進(jìn)入太空站用于研究工作，成為世界上首臺(tái)升上太空的流式細(xì)胞儀，證明其結(jié)構(gòu)緊湊，性能優(yōu)越的特點(diǎn)。2.流式細(xì)胞儀概述5.流式細(xì)胞儀分類：臨床型：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)便，易掌握，適用于臨床常規(guī)測(cè)試；科研型：分辨率高，選配多種波長(zhǎng)和類型激光器，可將感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上，適用于科研。2.流式細(xì)胞儀概述BD公司的流式細(xì)胞分析儀2.流式細(xì)胞儀概述BD公司的流式細(xì)胞分選儀2.流式細(xì)胞儀概述Beckman公司的流式細(xì)胞分析儀2.流式細(xì)胞儀概述Beckman公司的流式細(xì)胞分選儀：3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流動(dòng)室與液流系統(tǒng)激光光源與光學(xué)系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)分選系統(tǒng)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)圖3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)1.流動(dòng)室和液流系統(tǒng)流動(dòng)室：儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（壓力泵）：空氣泵+壓力傳感器3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流動(dòng)室：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出;鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出;流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流體的動(dòng)力學(xué)聚焦3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)：由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液

熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色

受清潔氣體壓力

從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)模擬圖3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)▲入管道前，邊緣與中心速度一致；▲入管道后，受管壁粘性阻力邊緣速度下降，中心速度不變；▲大約管道50倍直徑處，穩(wěn)定層流形成，產(chǎn)生流體聚焦效應(yīng)；▲液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)2.激光光源與光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、濾光片和小孔組成，它們將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)分別送入到不同的電子測(cè)控器。激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾光片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光）

FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)激光光源激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性目前主流產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)配置：(1)多采用氬離子激光器或氦氖激光器(2)一般選配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光(3)最多檢測(cè)13個(gè)熒光參數(shù)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

LongPassShortPassBandPass460500

540460

500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）光電倍增管(PMT：photomultipliertube)：放大電信號(hào),光靈敏度高；響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)；用于測(cè)定弱信號(hào)(SSC、FL1、FL2、FL3、FL4)。光電二極管：光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3.信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)由特異信號(hào)檢測(cè)器件和非特異信號(hào)檢測(cè)器件構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生非特異的散射光和特異的熒光信號(hào)。熒光信號(hào)由PMT檢測(cè),前向角散射光信號(hào)由光電二極管檢測(cè)。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)散射光的測(cè)定：細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向角散射光和側(cè)向角散射光。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)前向角散射光（FSC:forwardscatter）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)前向角散射光示意圖FALSSensorLaser3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)側(cè)向角散射光(SSC:sidescatter):激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，與細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)有關(guān)，對(duì)胞膜、胞質(zhì)、核膜變化更敏感，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)側(cè)向角散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞光散射測(cè)量最有效的用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)熒光測(cè)量熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。熒光素與特異抗體結(jié)合，熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)熒光激發(fā)及發(fā)射原理特點(diǎn)：熒光方向與SSC相同，SSC的波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)（雙色反射鏡和帶通濾光片將二者分開）3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)常用熒光染料的特性

熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)用途顏色FITC

488525免疫熒光綠色PE(RD1)

488575免疫熒光橙色ECD

488620免疫熒光橙紅PeCy5

488675免疫熒光紅PI

488620DNA染色橙紅PECy7

488

755免疫熒光深紅PerCP

488

670APC

633

6703.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)熒光信號(hào)線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量

線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。對(duì)細(xì)胞膜表面抗原等參數(shù)進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，通常使用對(duì)數(shù)放大器。

線性放大器

對(duì)數(shù)放大器3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)熒光信噪比

1.熒光信號(hào)主要包括兩部分：

①自發(fā)熒光：即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；

②特征熒光：即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。

自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。

2.減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：

①盡量選用較亮的熒光染料；

②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；

③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)4.分選系統(tǒng)分選目的：通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究。3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分選原理：3.流式細(xì)胞儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度、細(xì)胞回收率、分選得率。分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。4.流式細(xì)胞儀軟件介紹4.流式細(xì)胞儀軟件介紹4.流式細(xì)胞儀軟件介紹BD儀器軟件?基本應(yīng)用軟件：CellQuest:

完成儀器設(shè)置、數(shù)據(jù)獲取、統(tǒng)計(jì)分析等全能工具FACSComp:

自動(dòng)調(diào)整儀器設(shè)置?自動(dòng)化獲取分析軟件：1）SimulSET/MultiSET：雙色和多色免疫表型分析或絕對(duì)計(jì)數(shù)2）ProCOUNT：造血干/祖細(xì)胞自動(dòng)化分析，報(bào)告CD34+細(xì)胞絕對(duì)值3）HLA-B27分析軟件：血液T淋巴細(xì)胞HLA-B27定量分析4）ReticCOUNT：網(wǎng)織紅細(xì)胞自動(dòng)化分析?分析軟件：1）ModFit軟件：DNA周期、倍體和凋亡的自動(dòng)或手動(dòng)分析2）QuantiCALC：熒光定量分析，報(bào)告每個(gè)細(xì)胞抗體結(jié)合量（ABC），主要檢測(cè)白細(xì)胞表面分化抗原和細(xì)胞活化指標(biāo)3）PAINT-A-GATE：多維參數(shù)資料分析，同時(shí)分辨顯示多個(gè)細(xì)胞群體4）ATTRACTOR軟件：多參數(shù)資料的自動(dòng)快速批量分析?分選軟件：FACSDiva5.流式細(xì)胞儀其它5.流式細(xì)胞儀其它