westernblot詳細(xì)圖案解析

.Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”感謝閱讀用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以.檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)樣品丙烯酰胺SDSTris-HClβ-巰基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKCl試劑、試劑盒Na2HPO4KH2PO4ddH2O考馬斯亮蘭乙酸脫脂奶粉硫酸鎳胺H2O2DAB試劑盒電泳儀電泳槽離心機(jī)離心管硝酸纖維素儀器、耗材膜勻漿器剪刀移液槍刮棒一、試劑準(zhǔn)備SDS試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。感謝閱讀.3.轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；感謝閱讀SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容謝謝閱讀1000ml。0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。感謝閱讀膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%精品文檔放心下載脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H2021.0μl。感謝閱讀二、蛋白樣品制備單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì).兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。（2）每瓶細(xì)胞加3ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1謝謝閱讀min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10μlPMSF（100感謝閱讀mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）（4）每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，感謝閱讀于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）.（6）于4℃下12000rpm離心5min。（提精品文檔放心下載前開離心機(jī)預(yù)冷）（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于－20℃保存。組織中總蛋白的提?。?）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。（2）加400μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。（3）幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。（4）裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5感謝閱讀ml離心管中并置于－20℃保存。.加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。海?）將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500感謝閱讀rpm離心5min。（2）棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上感謝閱讀清后用PBS重復(fù)洗滌一次。（3）用槍洗干上清后，加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝謝謝閱讀于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。.三、蛋白含量的測定1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）從－20℃取出1mg/mlBSA，室溫融謝謝閱讀化后，備用。（2）取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分感謝閱讀別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，謝謝閱讀20.0mg，40.0mg。（3）按下表在各管中加入各種試劑。（4）混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)（Bio-Photometer，Eppendorf）感謝閱讀上比色分析。2. 檢測樣品蛋白含量（1）取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃精品文檔放心下載儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。.（2）取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/LNaCl精品文檔放心下載溶液100ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用無菌水洗一次。（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95ml0.15mol/L謝謝閱讀NaClNaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻謝謝閱讀后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5ml樣品含的蛋白量。四、SDS－PAGE電泳.1.清洗玻璃板一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。2.灌膠與上樣（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升精品文檔放心下載到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）.（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）（6）測完蛋白含量后，計(jì)算含50ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終.濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。電泳電泳時(shí)間一般4～5h，電壓為40V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。五、轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾.紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜。切精品文檔放心下載濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。謝謝閱讀將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。感謝閱讀要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一感謝閱讀.會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2h或40V轉(zhuǎn)移3h。感謝閱讀轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備.用。六、免疫反應(yīng)1. 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。感謝閱讀同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。謝謝閱讀.七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。精品文檔放心下載在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2min（20～25℃），溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10min，以膠片透謝謝閱讀.注意事項(xiàng)

明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生影響。精品文檔放心下載八、凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。收起一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。謝謝閱讀顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。.一、免疫反應(yīng)用0.01MPBS洗膜，5min×3次。謝謝閱讀加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2h。棄包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。感謝閱讀其他加入一抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃放置12h以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。感謝閱讀棄一抗和1%BSA，用0.01MPBS分別洗膜，5min×4次。感謝閱讀加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，精品文檔放心下載.室溫2h。7.棄二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4精品文檔放心下載次。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。謝謝閱讀展實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)樣品材料試裂解液PBSG250考馬斯亮藍(lán)溶液NaClSDS上樣緩沖液電泳緩沖液感謝閱讀劑、轉(zhuǎn)移緩沖液麗春紅染液封閉液TBSTTBS洗脫抗體緩沖液顯影液定影謝謝閱讀試劑液抗體化學(xué)發(fā)光試劑盒儀高壓鍋玻璃勻漿器高速離心機(jī)分光光度儀-20℃低溫冰箱垂直板電泳謝謝閱讀器、轉(zhuǎn)移裝置恒溫水浴搖床多用脫色搖床耗材實(shí)驗(yàn)一、操作步驟：.步驟蛋白樣品制備（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。孩俚沟襞囵B(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。精品文檔放心下載②每瓶細(xì)胞加3ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。謝謝閱讀③按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）精品文檔放心下載④每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。感謝閱讀⑤裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）精品文檔放心下載.⑥于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）精品文檔放心下載⑦將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。謝謝閱讀（2）組織中總蛋白的提?。孩賹⑸倭拷M織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。感謝閱讀②加400l單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。精品文檔放心下載③幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。精品文檔放心下載④裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。謝謝閱讀（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（1）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。褐x謝閱讀.①將培養(yǎng)液倒至1.5ml離心管中，于2500rpm離心5min。感謝閱讀②棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。感謝閱讀③用槍洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。感謝閱讀④將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。感謝閱讀蛋白含量的測定（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線①從-20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后，備用。感謝閱讀②取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。謝謝閱讀③按下表在各管中加入各種試劑。.5.0μ10.0μ20.0μ40.0μ0μg2.5μggggg1mg/mlBSA——2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl100μ97.5μ95.0μ0.15mol/LNaCl90.0μl80.0μl60.0μllllG250考馬斯亮藍(lán)溶1ml1ml1ml1ml1ml1ml液④混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。謝謝閱讀（2）檢測樣品蛋白含量①取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。謝謝閱讀室溫放置30min后即可用于測蛋白。②取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/LNaCl溶液100μl，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。謝謝閱讀③棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。謝謝閱讀.④取一管考馬斯亮藍(lán)加95μl0.15mol/LNaClNaCl溶液和5μl待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。精品文檔放心下載注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5μl樣品含的蛋白量。感謝閱讀SDS－PAGE電泳（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。精品文檔放心下載（2）灌膠與上樣①玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）精品文檔放心下載②按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即精品文檔放心下載.可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）謝謝閱讀③當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。感謝閱讀④按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。精品文檔放心下載⑤用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）精品文檔放心下載⑥測完蛋白含量后，計(jì)算含50μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。謝謝閱讀.⑦加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。謝謝閱讀（3）電泳電泳時(shí)間一般4～5h，電壓為40V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。感謝閱讀4.轉(zhuǎn)膜（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。精品文檔放心下載（2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。精品文檔放心下載.（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。感謝閱讀（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）精品文檔放心下載（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2h或40V轉(zhuǎn)移3h。感謝閱讀（6）轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。謝謝閱讀.5.免疫反應(yīng)（1）將膜用TBS