第十三章-體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)課件

第十三章體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)第十三章體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)1第一節(jié)胚胎工程第一節(jié)胚胎工程2胚胎工程是在胚胎移植技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和臨床上具有廣泛的應(yīng)用，它主要包括體外受精技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、胚胎分割技術(shù)、胚胎冷凍保存技術(shù)和性別控制技術(shù)等。近30年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，胚胎工程技術(shù)也日新月異，在促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展及其相關(guān)領(lǐng)域研究中取得了令人矚目的成就。胚胎工程是在胚胎移植技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù)，在畜3一、體外受精

體外受精(InVitroFertilization，IVF)是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，它的基本原理是在人工模擬體內(nèi)環(huán)境，包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、濕度、氣體、滲透壓、pH等），使卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中的初級(jí)卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)使精子獲能，完成受精。

一、體外受精體外受精(InVitroFe4

1959年，張明覺以家兔為實(shí)驗(yàn)材料，從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)，從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子，精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體兔的輸卵管中，其中4只妊娠，并產(chǎn)下15只健康仔兔，這是世界上首批試管動(dòng)物，它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立。1959年，張明覺以家兔為實(shí)驗(yàn)材料，從一只交配后5試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）試管小鼠(Whit-tingham，1968)6體外受精技術(shù)主要包括以下幾個(gè)主要方面：精子的采集與獲能、卵子的回收及成熟培養(yǎng)、體外受精、受精卵的體外發(fā)育及試管胚胎的移植等。體外受精技術(shù)主要包括以下幾個(gè)主要方面：精子的采集與獲能、卵子71.精子的獲能處理張明覺Austin1951年發(fā)現(xiàn)兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必須在生殖道中停留一段時(shí)間后才具備受精能力，這一現(xiàn)象稱為精子的獲能（capacitation）。

精子的獲能過程是多時(shí)期、多步驟的復(fù)雜變化過程，包括兩個(gè)階段，獲能的第一階段是脫出精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子（DecapacitationFactors，DF），增強(qiáng)了膜通透性。第二階段是精子細(xì)胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應(yīng)。1.精子的獲能處理張明覺Austin19582.卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)

（1）卵母細(xì)胞的采集①超數(shù)排卵

②從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞

③從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞

（2）卵母細(xì)胞的選擇

（3）卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)2.卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)（1）卵母細(xì)胞的采集93.體外受精

（1）常規(guī)體外受精技術(shù)將獲能精子與成熟卵子置于受精液中共同培養(yǎng)，使之完成受精過程。通常情況下，受精液與獲能液為同一種液體。（2）與分離精子相結(jié)合的體外受精技術(shù)將精子分離技術(shù)與體外受精技術(shù)結(jié)合起來(lái)生產(chǎn)預(yù)選性別的優(yōu)良胚胎,對(duì)加速家畜品種改良和畜牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。（3）顯微受精技術(shù)為了提高體外受精的成功率，借助顯微操作儀將精子直接注入卵母細(xì)胞質(zhì)或透明帶下，完成受精過程。顯微受精技術(shù)避免了由透明帶或卵質(zhì)膜所形成的受精障礙，使受精率和準(zhǔn)確率大大提高。3.體外受精（1）常規(guī)體外受精技術(shù)104.受精卵的體外培養(yǎng)

受精卵需要在培養(yǎng)液或輸卵管中發(fā)育到桑葚胚或囊胚階段，移植到受體后才能獲得較高的妊娠率。但體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，往往會(huì)停滯在某一階段不再發(fā)育，此現(xiàn)象稱之為“發(fā)育阻滯”。不同動(dòng)物體外發(fā)育阻滯出現(xiàn)的時(shí)期不同，小鼠為2細(xì)胞期，大鼠為8細(xì)胞期，牛和綿羊?yàn)?~16細(xì)胞，豬為4細(xì)胞期。

4.受精卵的體外培養(yǎng)受精卵需要在培養(yǎng)液或輸11目前，克服阻滯現(xiàn)象主要采用以下兩個(gè)方法：

一是改進(jìn)培養(yǎng)液成分，改善培養(yǎng)條件，盡量滿足早期胚胎發(fā)育所需物質(zhì)，確定并減除對(duì)其發(fā)育不利的成分；二是利用體細(xì)胞共同培養(yǎng)體系，以提供發(fā)育所需的物質(zhì)條件，目前廣泛采用的有輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體和顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)體系。

目前，克服阻滯現(xiàn)象主要采用以下兩個(gè)方法：125.體外受精的意義家畜體外受精技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展，已取得很大進(jìn)步，為實(shí)現(xiàn)動(dòng)物胚胎的工廠化生產(chǎn)提供了可能，對(duì)充分發(fā)揮良種母畜的繁殖潛力，加快家畜品種改良和優(yōu)良品種遺傳資源的開發(fā)與利用,加速畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。5.體外受精的意義13二、胚胎移植技術(shù)

所謂胚胎移植（embryotransfer）也稱受精卵移植，是指將良種母畜配種后，從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同種生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體技術(shù)，所以也稱為“借腹懷胎”。二、胚胎移植技術(shù)所謂胚胎移植（embryo141．供體、受體的選擇

胚胎移植的供體一般是選擇需要加速繁殖的有較大生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的健康的優(yōu)良畜種，受體則是繁殖能力較強(qiáng)的健康本地品種。1．供體、受體的選擇152．超數(shù)排卵

用前面所述的超數(shù)排卵技術(shù)，在母牛發(fā)情期（發(fā)情期當(dāng)天為零天）的第九天開始肌肉注射FSH，以遞減劑量連續(xù)注射4天，每天注射兩次（間隔12h），總劑量為300~400U；第三天的上下午，在注射FSH的同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇（PGF2α的類似物）各兩支（0.2mg/支）。2．超數(shù)排卵163．同步發(fā)情

同期發(fā)情又稱同步發(fā)情，就是利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情。3．同步發(fā)情174．人工受精

激素注射結(jié)束后，觀察到發(fā)情后１２小時(shí)，開始第一次輸精，時(shí)隔１２小時(shí)進(jìn)行第二次輸精，輸精量是常規(guī)量的兩倍。4．人工受精185．胚胎采集（1）手術(shù)法

5．胚胎采集（1）手術(shù)法19（2）非手術(shù)法

（2）非手術(shù)法206．胚胎的檢查與鑒定1）檢卵將收集的沖卵液于37℃溫箱內(nèi)靜置10一15分鐘。胚胎沉底后，移去上層液。取底部少量液體移至平皿內(nèi)，靜置后，在實(shí)體顯微鏡下先在低倍(10一20倍)下檢查胚胎數(shù)量，然后在較大倍數(shù)(50—100倍)下觀察胚胎質(zhì)量。

2）吸卵吸卵是為了移取、清洗、處理胚胎，要求目標(biāo)準(zhǔn)確，速度快，帶液量少，無(wú)丟失。吸卵可用1毫升的注射器裝上特別的吸頭進(jìn)行，也可使用自制的吸卵管。

3）胚胎質(zhì)量鑒定正常發(fā)育的胚胎，其中細(xì)胞(卵裂球)外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整。無(wú)卵裂現(xiàn)象(未受精)和異常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。6．胚胎的檢查與鑒定1）檢卵217．胚胎移植1）手術(shù)移植

先將受體母牛作好術(shù)前準(zhǔn)備。已配種母牛，在右肋部切口，找到非排卵側(cè)子宮角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宮角前端，注人胚胎；未配母牛在每側(cè)子宮角各注入一個(gè)胚胎；然后將子宮復(fù)位，縫合切口。

2）非手術(shù)移植非手術(shù)移植一般在發(fā)情后第六至第九天(即胚泡階段)進(jìn)行，過早移植會(huì)影響受胎率。在非手術(shù)移植中采用胚胎移植槍和0．25毫升細(xì)管移植的效果較好。將細(xì)管截去適量，吸入少許保存液，吸一個(gè)氣泡，然后吸人含胚胎的少許保存液，吸人一個(gè)氣泡，最后再吸取少許保存液。將裝有胚胎的吸管裝入移植槍內(nèi)，通過子宮頸插入子宮角深部，注入胚胎。非手術(shù)移植要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，以防生殖道感染。7．胚胎移植228．胚胎移植的意義①發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖力，迅速擴(kuò)大優(yōu)良畜種數(shù)量，加速優(yōu)良畜種的推廣應(yīng)用；②縮短世代間隔、增加選擇強(qiáng)度，促進(jìn)家畜改良速度；③長(zhǎng)期保存冷凍胚胎，便于優(yōu)良品種的種質(zhì)運(yùn)輸和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、性別鑒定和核移植等其它胚胎生物技術(shù)的基礎(chǔ)，也是基礎(chǔ)生命科學(xué)研究的重要手段。8．胚胎移植的意義23三、胚胎分割技術(shù)所謂胚胎分割（embryosplitting）即是將一枚胚胎用顯微手術(shù)的方法分割成二分、四分甚至八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術(shù)，也是胚胎克隆的一種方法。三、胚胎分割技術(shù)24胚胎分割的方法（1）顯微針分割法該法適用于卵裂球階段的胚胎。操作時(shí)在顯微操作儀下將胚胎固定，用玻璃針在透明帶上作一切口，將卵裂球從透明帶中移出，并吹吸卵裂球使之離散，將其裝入2個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的空透明帶內(nèi)，進(jìn)行移植。該方法具有較高的同卵雙生率，但操作程序復(fù)雜。（2）顯微刀分割法該法適用于對(duì)桑葚胚和早期囊胚進(jìn)行分割。在顯微操作儀下固定胚胎，用特制顯微刀片將胚胎均勻一分為二，分別裝入空透明帶中，進(jìn)行移植。（3）酶軟化透明帶后顯微分割法用0.5%的鏈霉蛋白酶軟化胚胎透明帶,若是緊密化胚胎(如桑椹胚),則需在無(wú)鈣、鎂的平衡鹽溶液中處理20分鐘,使胚胎去緊密化，將胚胎固定，把將針置于欲分割的胚胎上面,使其與胚胎呈30度角,對(duì)準(zhǔn)胚胎的正中平分線徐徐下壓，即可將一個(gè)胚胎分割成兩半。（4）酶消化去透明帶后分割法用0.25%～0.5%的鏈霉蛋白酶去掉胚胎透明帶,然后用顯微玻璃針或微手術(shù)刀將裸胚一分為二。（5）徒手分割法徒手分割法主要適用于分割體積較大的胚胎，其優(yōu)勢(shì)在于可以不用顯微操作儀。在立體顯微鏡下，用止血鉗夾住切割刀片，將透明帶切開一部分，再用直徑略小于胚胎的毛細(xì)管吹吸幾次，胚胎從透明帶中脫出。手持玻璃針自上而下對(duì)稱切割裸胚。這種方法多用于分割桑椹胚和囊胚。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，便于生產(chǎn)應(yīng)用，但要求要有較為靈巧的操作技能。胚胎分割的方法25盡管胚胎分割技術(shù)已在多種動(dòng)物包括人類取得成功，但是仍然存在很多問題須作深入研究。（1）胚胎分割產(chǎn)生的后代初生體重低，在牛切割胚胎移植實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有些分割胚即使培養(yǎng)到囊胚階段與正常胚胎相比，細(xì)胞數(shù)明顯減少，移植后代的體重也相應(yīng)降低。這可能與早期胚胎細(xì)胞的分化和定位有關(guān)，但發(fā)育機(jī)理還有待深入研究。（2）還有遺傳一致性問題，同一胚胎切割后獲得的后代，在理論上，遺傳性狀應(yīng)該完全一致，但事實(shí)并不這樣。人們發(fā)現(xiàn)6~7日齡牛胚胎分割后，同卵雙生犢牛的毛色和斑紋并不完全相同，而在2-細(xì)胞階段分割，卻表現(xiàn)出遺傳一致性。這種現(xiàn)象與胚胎細(xì)胞的分化有密切關(guān)系，但目前對(duì)不同階段胚胎細(xì)胞的分化時(shí)間和發(fā)育潛力了解很少；（3）最后還存在同卵多胎的局限性，從目前的研究來(lái)看，由一枚胚胎通過胚胎分割方式獲得的后代數(shù)量有限。迄今，最好的結(jié)果是由一枚牛胚胎獲得3個(gè)牛犢，這說明孿生胚胎的發(fā)育潛力很有限。因此，通過胚胎分割技術(shù)生產(chǎn)大量克隆動(dòng)物目前難以取得進(jìn)展。2.胚胎分割目前存在的問題和發(fā)展前景盡管胚胎分割技術(shù)已在多種動(dòng)物包括人類取得成功，26第二節(jié)核移植與動(dòng)物克隆第二節(jié)核移植與動(dòng)物克隆27一、什么是動(dòng)物克??？

動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。一、什么是動(dòng)物克??？動(dòng)物克隆是一種通過核移植28核移植技術(shù)：所謂核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。核移植技術(shù)：所謂核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)29胚胎克?。菏褂玫暮斯w細(xì)胞如果來(lái)自多細(xì)胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆。體細(xì)胞克隆：使用的核供體細(xì)胞來(lái)自動(dòng)物體，叫做

體細(xì)胞克隆。胚胎克?。菏褂玫暮斯w細(xì)胞如果來(lái)自多細(xì)胞階段30第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件31第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件32第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件33第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件34二、兩棲類細(xì)胞核移植1938年Spemann最先提出將多細(xì)胞胚胎的每一個(gè)細(xì)胞核移植到去掉核的卵母細(xì)胞中，使它們重新發(fā)育成胚胎的設(shè)想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首次獲得兩棲動(dòng)物美洲豹蛙胚胎細(xì)胞核移植的后代．核供體為囊胚期的胚胎細(xì)胞——實(shí)驗(yàn)成功核供體為原腸胚期的中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞——實(shí)驗(yàn)失敗二、兩棲類細(xì)胞核移植1938年Spemann最先提出將多細(xì)胞351958年到1962年，英國(guó)劍橋大學(xué)的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以同樣的方法，用青蛙腳蹼角質(zhì)化細(xì)胞進(jìn)行移核試驗(yàn)，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。1958年到1962年，英國(guó)劍橋大學(xué)的JohnGurdon36三、魚類的核移植從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍魚為材料，進(jìn)行魚類不同亞科間的細(xì)胞核移植獲得成功，用以研究雜交細(xì)胞核與純種細(xì)胞核在發(fā)育功能上的差異，以及細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞核的影響．三、魚類的核移植從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍371979年，中國(guó)科學(xué)院武漢水生物研究所利用鯽魚做移核試驗(yàn)。他們把鯽魚囊胚期細(xì)胞經(jīng)過385天59代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，再將此種培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到同種鯽魚的未受精卵中。到1980年4月，他們成功地培育了兩尾無(wú)性繁殖的幼魚，其中一條發(fā)育正常。1979年，中國(guó)科學(xué)院武漢水生物研究所381989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細(xì)胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實(shí)現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎39四、哺乳類的細(xì)胞核移植1977年，美國(guó)緬因州巴爾港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室用“亞無(wú)性繁殖”的方式，培育出7只單親小鼠。四、哺乳類的細(xì)胞核移植1977年，美國(guó)40將卵細(xì)胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有適量細(xì)胞松馳B的溶液中。經(jīng)此番處理的卵細(xì)胞的染色體復(fù)制后出現(xiàn)了兩個(gè)核，將此雙核細(xì)胞放入正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。卵中的雙核細(xì)胞自動(dòng)融合，并且細(xì)胞開始分裂。將此種胚胎移入母鼠子宮培育。生產(chǎn)出7只單親小鼠。將卵細(xì)胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有適411981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室合作，首次對(duì)小鼠卵進(jìn)行移核試驗(yàn)獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育至囊胚期，再將此胚胎移入同步孕鼠子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育的個(gè)體。1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和美國(guó)杰克遜42第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件43五、核移植技術(shù)的一般操作程序

核移植克隆哺乳動(dòng)物的技術(shù)操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟。五、核移植技術(shù)的一般操作程序核移植克隆哺乳441．核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞。這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開始個(gè)體發(fā)育過程。卵母細(xì)胞的來(lái)源有兩種方式：一是用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MⅡ卵母細(xì)胞。二是從屠宰場(chǎng)收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。1．核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備452．核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備在核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動(dòng)物完整的基因組；其次，供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過程。

供體細(xì)胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細(xì)胞。另外，核供體細(xì)胞的來(lái)源還有胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。

2．核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備463．細(xì)胞核移植

常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個(gè)外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的方法。透明帶下注射則是把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合。3．細(xì)胞核移植474．激活卵母細(xì)胞的激活涉及的因素很多，無(wú)論是受精引起的卵母細(xì)胞激活還是人工的激活，都會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)生一系列的反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)。4．激活485．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)

經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內(nèi)培養(yǎng)方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入休情期的母羊結(jié)扎的輸卵管中體內(nèi)培養(yǎng)4-7d，發(fā)育至桑椹胚和囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內(nèi)作體內(nèi)培養(yǎng)7d，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)496.胚胎移植前性別的控制對(duì)于較高等的動(dòng)物，如家畜等，可以利用X、Y精子分離和胚胎性別鑒定技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)性別控制。依賴X和Y型精子不同的特性，人們?cè)噲D分離精子。早在1925年，Lush就通過離心法分離兔子的X與Y精子，但沒有成功。后來(lái)，人們?cè)噲D通過受精前陰道輸入精氨酸，改變生殖道pH的方式選擇性利用精子來(lái)控制性別比率為目的。pH值堿性，雌兔比例高，但結(jié)果不穩(wěn)定。利用免疫親和柱層析技術(shù)的方法，可以將表達(dá)H-Y抗原的Y精子于不表達(dá)的X精子分開。6.胚胎移植前性別的控制對(duì)于較高等的動(dòng)物，如家畜等，可以利50利用流式細(xì)胞儀鑒定精子DNA的含量，可以將X與Y精子分開。這類方法目前對(duì)精子分離的準(zhǔn)確率為79％，對(duì)Y精子分離的準(zhǔn)確率為70％。其主要缺點(diǎn)是分離速度慢，一臺(tái)分類器1小時(shí)僅能分離40萬(wàn)個(gè)精子，不夠一次子宮頸內(nèi)輸精應(yīng)用，只能通過手術(shù)進(jìn)行輸卵管輸精。利用流式細(xì)胞儀鑒定精子DNA的含量，可以將X與Y精子分開。這51溫度對(duì)某些生物而言，是一條控制性別發(fā)育的途徑。例如:鱷魚的性別完全由胚胎發(fā)育的溫度所決定，受精卵在30度發(fā)育起來(lái)的全是雌性，34度以上，孵化起來(lái)的全是雄性。另外，在牡蠣、蛙、和鱉等動(dòng)物中也存在這樣的現(xiàn)象。溫度對(duì)某些生物而言，是一條控制性別發(fā)育的途徑。52性激素也可以控制性別，這甚至在鳥類和其它一些高等哺乳動(dòng)物中也有體現(xiàn)，只是不同的動(dòng)物受影響的程度有所不同罷了，這在魚類性別控制中有廣泛的應(yīng)用。利用甲基睪丸素、雄性激素等可以實(shí)現(xiàn)性反轉(zhuǎn)得到全部雄性個(gè)體，但指數(shù)表現(xiàn)型改變，不能遺傳。性激素也可以控制性別，這甚至在鳥類和其它一些高等哺乳動(dòng)物中也53如果調(diào)整陰道酸堿度，也可以達(dá)到性別篩選的目的。當(dāng)陰道液偏酸時(shí)，Y型精子移動(dòng)慢，而X型精子速度快，因而受精卵是XX的概率高；反之，易形成XY的雄性合子。該法的成功率為80％。如在精液中加入睪丸，胎血、腦垂體等生物制劑或激素，也可控制生物性別，該法的成功率也有60～70％。在低等動(dòng)物中，通過人工雌雄核發(fā)育，三倍體激素等實(shí)現(xiàn)性別控制。如果調(diào)整陰道酸堿度，也可以達(dá)到性別篩選的目的。當(dāng)陰道液偏酸時(shí)54性別鑒定雌性胚胎中存在的X染色體相關(guān)酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因可以對(duì)植前胚進(jìn)行性別鑒定。胚胎性別鑒定研究注意采用四種方法：細(xì)胞遺傳學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法

性別鑒定雌性胚胎中存在的X染色體相關(guān)酶的活性、雄性胚胎存在的55細(xì)胞遺傳學(xué)方法：指通過核型分析對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定。其準(zhǔn)確率為100％，但獲得高質(zhì)量的中期染色體分散相難度很大。生物化學(xué)微量分析法：指通過測(cè)定與X染色體相關(guān)聯(lián)的酶活性來(lái)鑒定雌性胚胎的一種方法。其原理是早期雌性胚胎的兩條X染色體中必有一條失活，在胚胎基因組的激活與X染色體失活之間的短暫時(shí)期內(nèi)，雌性的兩條X染色體都可以被轉(zhuǎn)移，這反映在雌性胚胎中與X染色體相關(guān)連的細(xì)胞內(nèi)濃度及活性是雄性胚胎的兩倍。此點(diǎn)可作為進(jìn)行胚胎性鑒的依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)方法：指通過核型分析對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定。其準(zhǔn)確率為56免疫學(xué)方法：利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而進(jìn)行胚胎性別鑒定的一種方法。對(duì)胚胎的H-Y抗原檢測(cè)有三種方法：即細(xì)胞毒性分析法、間接免疫熒光分析法和囊胚形成抑制法。免疫學(xué)方法：利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測(cè)胚胎上是否57細(xì)胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補(bǔ)體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中對(duì)胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，將在培養(yǎng)過程中繼續(xù)發(fā)展發(fā)育胚胎分類微H-Y－（雌性），將出現(xiàn)個(gè)別卵裂球溶解以及不能發(fā)育到囊胚期者分類為H-Y＋（雄性），用這種方法鑒定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％為雌性。但該方法是以破壞一部分胚胎為代價(jià)。細(xì)胞毒性分析法:將H-Y抗血清與補(bǔ)體（豚鼠血清）加入培養(yǎng)液中58間接免疫熒光法:將胚胎先用H-Y抗體處理30分鐘，再用異硫氰酸鹽熒光素（FITC）標(biāo)記的二抗處理，根據(jù)特異熒光判斷，有熒光者為雄胚，無(wú)熒光者為雌胚，將兩類胚胎移植后，判為雄胚者有78％發(fā)育成雄鼠，判微雌胚者有81％發(fā)育為雌鼠。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是不損害胚胎，亦具有適當(dāng)?shù)男詣e鑒定準(zhǔn)確率，但對(duì)熒光強(qiáng)度的估價(jià)則具有高度的主觀性。此外,胚胎質(zhì)量似乎也與熒光強(qiáng)度和類型有關(guān)，第二抗體有時(shí)發(fā)生非特異性結(jié)合，如與同卵周隙的細(xì)胞碎片結(jié)合等。間接免疫熒光法:將胚胎先用H-Y抗體處理30分鐘，再用異硫氰59囊胚形成抑制法:利用H-Y抗體對(duì)雄性桑椹胚向囊胚發(fā)育具有可逆性抑制的原理發(fā)展起的一種胚胎性別鑒定法。這種方法是一種簡(jiǎn)單而有效的胚胎性別鑒定方法。不足之處是容易將一部分發(fā)育遲緩的雄性胚胎誤判為雌性胚胎囊胚形成抑制法:利用H-Y抗體對(duì)雄性桑椹胚向囊胚發(fā)育具有可逆60分子生物學(xué)方法:指從胚胎取下少量細(xì)胞，將其DNA與Y染色體特異標(biāo)記的DNA序列（探針）雜交。在類似的研究中，用生物素標(biāo)記的Y特異性探針進(jìn)行原位雜交，準(zhǔn)確率達(dá)100％。此法的優(yōu)點(diǎn)是不用放射性標(biāo)記、設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)難度低，且可在24小時(shí)之內(nèi)得到結(jié)果.缺點(diǎn)是可鑒定的胚胎較少。通過聚合酶連式反應(yīng)擴(kuò)增Y染色體DNA可大大增加靈敏度，改善準(zhǔn)確度。這種方法分析的靈敏度之高，甚至單個(gè)精子細(xì)胞的性別也可在3小時(shí)之內(nèi)鑒定出來(lái)。當(dāng)前用PCR進(jìn)行胚胎性別鑒定的最大問題是污染，在采胚細(xì)胞時(shí)采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一個(gè)胚胎的細(xì)胞、空氣中的污染、PCR、試劑的污染以及培養(yǎng)液中的BSA、FCS都可能成為污染源、引致假陽(yáng)性結(jié)果。這就對(duì)操作過程提出了更嚴(yán)格的要求分子生物學(xué)方法:指從胚胎取下少量細(xì)胞，將其DNA與Y染色體特617．胚胎移植重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。7．胚胎移植62六、核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，

進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)；2．培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群；3．開展異種動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物；4．與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆5．利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問題。六、核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，

進(jìn)行生物藥物63七、克隆羊與體細(xì)胞核移植七、克隆羊與體細(xì)胞核移植64a.胚胎細(xì)胞株,b.胚胎纖維母細(xì)胞

c.乳腺上皮細(xì)胞,d.PCRmicrosatellitea.胚胎細(xì)胞株,b.胚胎纖維母細(xì)胞

c.乳腺上皮細(xì)胞,d65第十三章--體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)ppt課件66第一步取妊娠期的6歲母綿羊（FinnDorset白品種母羊）的乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用饑餓法使其進(jìn)入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。第一步67第二步注射促性腺激素，促使母羊（So