PCR檢測常見問題與解決途徑

PCR檢測常見問題與解決途徑 xxxx xxxx【】【】【】【】PCR檢測常見問題與解決途徑利用PCR方法檢測轉基因成分時，常常消滅假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結果得出錯誤結論，有時可造成嚴峻后果。為了提高轉基因檢測的準確性和牢靠性，PCR檢測應盡量削減假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復性、重現(xiàn)性、魯棒性，盡量削減假陽性、假陰性和非特異性擴增。本文對PCR檢測中消滅的假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶的緣由及其解決方法予以綜述。一、假陽性：〔一〕假陽性現(xiàn)象性。試驗中設立的陰性比照可提示有無假陽性結果消滅?！捕吃斐杉訇栃缘木売蓵r，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間穿插污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、PCR核酸模板污染。PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反響中最主要最常見的污染問題。由于PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。地搖動反響管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質粒，由于活細胞的生長生殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學試驗室及某些用克隆質粒做陽性比照的檢驗室，這個問題比較常見。〔三〕假陽性問題的試驗把握在每次PCR檢測時，確定設立陰性比照樣品和陽性比照樣品。陰性比照樣品檢測為陰性時，說明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性比照樣品檢測為陽性時，說明DNA提取〔RNA提取、RNA反轉錄〕、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性比照樣品和陽性比照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進展判定。只有設立試驗全程的比照，才能證明試驗結果成立。造成假陰性的緣由可以通過設置試驗比照來查找。試驗比照包括：1、DNA陽性比照：以含有目的片段的DNA(或質粒〕作為模板進展擴增，證明PCR試劑是否有效、擴增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段?！擦粢猓宏栃詷悠窋U增效率高，應嚴格把握，避開其成為潛在的污染源〕。2、DNA陰性比照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進展擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白比照：以純水作為模板進展擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物比照：在與陽性比照一樣的反響體系中，參與一樣數(shù)量的待測樣品DNA，假設未擴增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取比照：空白提取比照擴增結果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取比照：陽性提取比照擴增結果為陰性，說明提取過程可能有誤。假設DNA陽性比照擴增結果為陰性，或者DNA陰性比照和空白比照擴增PCR試劑或擴增過程存在問題。〔四〕假陽性解決途徑由于PCR的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產(chǎn)物污染標本或反響管即可消滅假陽性。尤其是PCR擴增產(chǎn)物和質粒分子很簡潔造成試驗室的污染，導致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。1、標準試驗室設計試驗室設置上安排液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。物流應按安排液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)挨次，嚴禁倒流。在連續(xù)而獨立的空間中完成不同試驗步驟。不同工作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。PCR前處理區(qū)〔樣品制備室、DNA提取室〕和PCR預備室設置正壓通風系統(tǒng)，并設置通風柜或生物反響柜造成局部負壓；后PCR室〔PCR室及電泳室為高度污染區(qū)〕設置負壓通風系統(tǒng)，防止大量游離分子及氣溶膠，對其它區(qū)域造成環(huán)境污染。配制PCR反響體系〔配備冰箱及生物安全柜，此試驗室要求無模板DNA存在〕和向PCR反響體系中參與模板DNA〔配備生物安全柜及冰箱〕要求在不同區(qū)域進展。2、標準試劑耗材治理驗證：購置的試劑需進展試驗前驗證；分裝：雙蒸水、引物和dNTP均應分裝儲存，并標明日期，以防污染；試劑的分裝應在裝有紫外燈的超凈工作臺上進展；試劑分裝成小份一次使用后棄去。要時，在加樣本前，反響管和試劑用紫外線照耀，以破壞存在的核酸。3、標準試驗室操作把握污染源：PCR產(chǎn)物和質粒操作空間是最大的污染源，應嚴格防止將這個空間的物品帶出；一次性反響管和離心管；定期消毒：定期對試驗室進展紫外照耀，用10%漂白劑、3％雙氧水或專用商業(yè)產(chǎn)品清理試驗室臺面及死角。定期通風：對試驗室定期進展正壓、負壓通風處理；管外；加樣時，最終加陽性比照。4、技術處理在DNA模板和多聚酶參與前，紫外線照耀反響管內(nèi)容物以破壞污染的PCR254nm30min〔Nature1990，34:27〕；PCR試驗中使用dUTP，而不用dTTP。在擴增前使用UraciIN一g1ycosylase〔尿嘧啶糖基化酶〕處理可降解穿插污染的PCR產(chǎn)物，而不降解基困組DNA模板，然后熱滅活此酶，再進展擴增反響〔Gene，1990，93：125〕PE公司供給此類試劑盒；在PCR反響前參與一種光化學試劑，反響完成后激活該試劑，光化學DNA鏈，使之不能再擴增〔NucleicAcidsRes，1991，19：99〕。二、假陰性〔一〕假陰性現(xiàn)象與推斷方法假照試驗中設置的陽性比照未能擴增成陽性結果，提示本次試驗中可能有假陰性結果。但這里應留意，很多國產(chǎn)PCR試劑盒中陽性比照承受質粒DNA，和標本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，假設在標本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性比照均呈陽性，標本檢測中還可能有假陰性。的結果可能有問題。〔二〕造成假陰性的緣由儀器因素PCR試驗對儀器的依靠性是很高的，離心機、擴增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴增儀的主要問題是孔間差，引起擴增失敗或擴增效率降低。而離心機的影響則更簡潔被無視。國內(nèi)使用離心機很少使用離心加速度〔XXXg〕作為參數(shù)指標，而常使用轉數(shù)作為參數(shù)指標，這里就存在著一個問題，由于離心機的大小不同，有效跳心半徑也不一樣，因此同樣的轉速所產(chǎn)生的離心力相差很大(有的在數(shù)倍以上)，所以在一樣的離心時間下，有可能模板并沒有離心下來，造成PCR假陰性。這個問題在其他試驗也有，但因其他試驗都是測定大分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機的試驗要留意一下這個問題。試劑質量問題PCR試驗的成功與否試劑的質量至關重要，試劑的質量問題涉及多個方面：細胞的裂解；模板的抽提；引物位點的選擇；Taq酶的活性等等。其中任PCR試劑格外重要?；虿粔蚨鴮е录訇幮浴Ｐ枇粢獾氖怯袝r忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不抱負、簡潔彌散的常見緣由。有些批號的引物合成質量有問OD值，更要留意引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，確定要有引物條帶消滅，而且兩引物帶的亮度應大體全都，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡，導致引物變質降解失效。核酸模板問題1〕模板中含有雜蛋白質；2〕模板中含有Taq酶抑制劑；模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；在提取制備模板時喪失過多，或吸入酚；模板核酸變性不徹底。定不宜任憑更改。4、物理緣由：PCR儀控溫不準，也是PCR失敗的緣由之一。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀內(nèi)的變性、退火和延長溫度。5、靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。6．操作人員素養(yǎng)問題PCR試驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設計錯誤等等都能造成結果的假陰性?！踩臣訇幮詥栴}的試驗把握在每次PCR檢測時，確定設立陰性比照樣品和陽性比照樣品。陰性比照樣品檢測為陰性時，說明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性比照樣品檢測DNA提取〔RNA提取、RNA反轉錄〕、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性比照樣品和陽性比照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進展判定。造成假陰性的緣由可以通過設置試驗比照來查找。試驗比照包括：1、DNA陽性比照：以含有目的片段的DNA(或質?！匙鳛槟０暹M展擴增，證明PCR試劑是否有效、擴增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段?！擦粢猓宏栃詷悠窋U增效率高，應嚴格把握，避開其成為潛在的污染源〕。2、DNA陰性比照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進展擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白比照：以純水作為模板進展擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物比照：在與陽性比照一樣的反響體系中，參與一樣數(shù)量的待測樣品DNA，假設未擴增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取比照：空白提取比照擴增結果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取比照：陽性提取比照擴增結果為陰性，說明提取過程可能有誤。DNADNA陰性比照和空白比照擴增PCR試劑或擴增過程存在問題?！菜摹臣訇幮越鉀Q方案1．反響體系不靈敏：1〕檢查PCR試劑是否失效；2〕檢驗引物是否降解：3〕PCR擴增體系與程序。2、PCR反響存在抑制物：〔1〕稀釋模板DNA，進展擴增分析；〔2〕純化模板DNA，除去蛋白質、多酚、多糖等抑制物；〔3〕檢測PCR體系中是否含有擴增抑制物。3、DNA提取失敗：1〕選擇與優(yōu)化樣品DNA提取方法；2〕驗證DNA提取試劑是否失效。三．非特異擴增〔一〕現(xiàn)象PCR擴增后消滅的條帶與估量的大小不全都，或大或小，或者同時消滅特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的消滅，(二〕緣由：引物設計與濃度問題G+C40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易消滅非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避開5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避開引物內(nèi)部消滅二級構造，避開兩條引物間互3”端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。引3”端的堿基，特別是最末及倒數(shù)其次個堿基，應嚴格要求配對，以避開因末端堿基不配對而導致PCR失敗。引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物濃度：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量引物之間形成二聚體的時機。Mg2+PCRdNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反響特異性降低，消滅非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反響產(chǎn)物削減。40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)DNA比引物簡潔得多，引物和模板之間的碰撞結合時機遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為抱負。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇適宜的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大削減引物和模板間PCR30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。PCRDNA25-30PCR產(chǎn)物中非25-30輪循環(huán)擴增后，反響中TaqDNA聚合酶已經(jīng)缺乏，假設此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重參與各種反響底物進展擴增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴增水平可達109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關，擴增產(chǎn)物的量可用以下公式表示:C＝Co(1+P)n。其中：C為擴增產(chǎn)物量,C0為起始DNA量,P為增效率,n為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期，由于產(chǎn)物積存，使原來呈指數(shù)擴增的反響變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物連續(xù)大量擴增，到達較高水平。因此，應適當調整循環(huán)次數(shù)，在平臺期前完畢反響，削減非特異性產(chǎn)物。酶的質和量，催化一典型的PCR反響約需酶量2.5U(指總反響體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量削減。往往一些來源的酶易消滅非特異條帶而另一來源的酶則不消滅，酶量過多有時也會消滅非特異性擴增。四．PCR擴增消滅涂抹帶1、緣由：往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。2、對策：削減酶量，或調換另一來源的酶；dNTP的濃度；適當降低Mg2+濃度；增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。五、標準問題轉基因成分檢測一般依據(jù)標準方法進展，引物和PCR反響體系一般都經(jīng)過了嚴格的循環(huán)驗證。有時標準方法可能存在問題，導致假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶的產(chǎn)生。標準方法可能存在的問題有：引物設計不適宜：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進展PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，簡潔消滅假陽性。Mg2+Mg2+PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。PCR擴增承受的體積為20ul30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進展PCR擴增，是依據(jù)檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，確定要模索條件，否則簡潔失敗。PCR溫度設置不合理：變性對PCR低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。六、檢測極限問題當樣品中轉基因成分很低時，反響體系內(nèi)可能不含有擴增模版，因而簡潔造成假陰性結果。PCR理論檢測極限是在反響體系中存在一個拷貝的目標DNA分子，由于人的判讀力氣限制和PCR效率等緣由，定性檢測實際極限值一般是理論檢測極限值的10-30倍。也就是說，假設轉基因成分低到檢測極限時，檢測不到轉基因成分的可能性會很大，或者說消滅假陰性的概率很大。消滅假陰性的緣由是由于抽樣誤差，反響體系中不存在有效擴增的模版分子。此時PCR檢測的。依據(jù)作物基因組的大小，可以計算出不同作物的理論檢測極限并估量出實際檢測極限。例如在100微升的反響體系中，小麥基因組有0.58萬個拷貝，一個轉基因拷貝的重量比〔理論檢測極限〕是0.0174%，玉米的理論檢測極限是0.003，其他作物的理論檢測極限一般在0.001%-0.01%。假設反響體系是20微升，理論檢測極限值將提高5倍，小麥為0.085%，玉米為0.015%，其他作物將在0.005-0.05%之間。反響體系是20微升的定性檢測實際極限值一般是在0.05-0.5%。低于這個含量時，反響體系中有時不含擴增模版DNA，因此很難得到正確的檢測結果。七．怎樣查找污染源假設不慎發(fā)生污染狀況，應從下面幾條動身，逐一分析，排解污染?！吃O立陰陽性比照：有利于監(jiān)測反響體系各成分的污染狀況。選擇陽，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性比照的選擇亦要慎重，由于PCR敏感性極高，可以從其它方法〔Sourthern印跡或點雜交等〕檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機比照，即包括PCR反響所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是格外有益的。假設擴增結果中試劑比照為陽性結果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批的試劑進展擴增，擴增時設立不同的反響管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。〔二〕環(huán)境污染：在排解試劑污染的可能性外，更換試劑后，假設不久又覺察試劑被污染了，假設預防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1.模板提取時真空抽干裝置；2.凝膠電泳加樣器；3.電泳裝置；4.紫外；5.切膠用刀或手術刀片；6.離心機；7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或試驗臺面等；此時可用擦拭試驗來查找可疑污染源：1〕用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2〕0.1ml去離子水浸泡；3〕5mlPCR試驗；4〕電泳檢測結果。8.氣溶膠。假設經(jīng)過上述追蹤試驗，仍不能查找到精準污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應當更換試驗場所，假設條件不允許，則重設計的引物〔與原引物無相關性〕。八．污染處理〔一〕環(huán)境污染稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使剩余DNA脫嘌呤；紫外照耀〔UV〕法：紫外波長〔nm〕一般選擇254/300nm，照耀30min即可。需要留意的是，選擇UV作為消退殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照耀僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照耀時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延長終止，但并不是DNA鏈中全部嘧啶均能形成二聚體，且UV照耀還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照耀的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷〔如環(huán)丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等〕均可終止TaqDNA聚合酶的延長。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當。假設這些位點〔0.13/堿基〕在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，假設100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有很多UV照耀有確定的片段長度限制的緣由?！捕撤错懸何廴究沙惺芤韵路椒ㄖ惶幚恚篋NaseI法：PCR混合液〔Taq聚合酶〕參與0.5UDNaseI30min后加熱滅活，然后參與模板和Taq聚合酶進展正常PCR擴DNA的序列；4個堿基的內(nèi)切酶〔如MspI和TaqI等〕，可同1h后加熱PCR；紫外照耀法：未加模板和TaqPCR混合液進展紫外照耀，留意UV照耀法；g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使PCRPCR，g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自DNA的?！踩衬蜞奏ぬ擒彰浮睻NG〕法由于UV照耀的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢PCR300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和確定。1.PCR產(chǎn)物或引物中用dUdTdUPCR產(chǎn)物與UNGUDGN-糖基鍵，可除dUTaqDNA聚合酶的延長，從而失去被再擴增的力氣。UNG對不dU的模板無任何影響。UNGDNA中消退尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。.dUTPdUTPdTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進展PCR擴增前，用UNGPCR混合液即可消退PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNGPCRdU的的PCR產(chǎn)物。dU引