大腸桿菌及其檢驗(yàn)

大腸桿菌及其檢驗(yàn)大腸桿菌的生物學(xué)特性簡介：ATCC11775附：腸桿菌科各屬80%，而與同科的志賀氏菌屬〔除鮑氏志賀氏菌外〕DNA80-87%。腸道外感染。形態(tài)與染色大小0.4～0.7×1～3um,無芽胞,大多數(shù)菌株有動力。有一般菌毛與性菌毛，有些菌株有多糖類包膜，革蘭氏陰性桿菌。附：有動力是什么意思？請看動力試驗(yàn)。請看革蘭氏染色介紹。大腸桿菌掃描電鏡照片大腸桿菌分裂照片培育特性良好。條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。在一般養(yǎng)分瓊脂上生長表現(xiàn)3種菌落形態(tài)：110鹽水中簡潔分散。粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。粘液型：常為含有莢膜的菌株。pH6.8-8.0，所用培育pH7.0-7.5pH6.08.0菌落形態(tài)學(xué)生化反響阿拉伯膠等產(chǎn)酸產(chǎn)氣。IMViC試驗(yàn)為“+、+、-、-”。即為典型大腸桿菌?？乖瓨?gòu)造比較簡單，主要由O抗原、鞭毛HK抵抗力，55℃6060℃15仍有局部細(xì)菌存活。R致瀉性大腸桿菌簡介外感染。為致瀉性大腸桿菌〔enterovirulentE.coli〕。一般包括四種：腸毒素性大腸桿菌〔ETEC〕致病性大腸桿菌〔EPEC〕腸產(chǎn)毒性大腸桿菌腸致病性大腸桿菌腸侵襲性大腸桿腸出血性大腸桿感染部腸產(chǎn)毒性大腸桿菌腸致病性大腸桿菌腸侵襲性大腸桿腸出血性大腸桿感染部位腹瀉類型易感人腸產(chǎn)毒性大腸桿菌〔EnterotoxigenicE.coli,ETEC〕：引起嬰幼兒和旅2～3天即愈。養(yǎng)分不良者可達(dá)數(shù)周，也可反復(fù)發(fā)作。致病因素是LT或ST，或兩者O6：K15：H16、O25：K7：H42。ETEC腸致病性大腸桿菌〔EnteropathogenicE.coli,EPEC〕:是嬰兒腹瀉的主狀緣破壞、絨毛萎縮、上皮細(xì)胞排列紊亂和功能受損，造成嚴(yán)峻腹瀉。EPECLTST。有人報(bào)道，EPECVero細(xì)胞〔綠猴腎傳代細(xì)胞〕有毒性，故稱VTVT毒素相像，具有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素性。鑒定EPEC可依據(jù)臨床表現(xiàn)與血清型。(3)腸侵襲性大腸桿菌〔EnteroinvasiveE.coli,EIEC〕:EIEC的多數(shù)菌株無動力，生化反響和抗原構(gòu)造均近似痢疾桿菌，應(yīng)予留意。腸出血性大腸桿菌〔EnterohemorrhagicE.coli,EHEC〕:引起散發(fā)性或爆發(fā)性出血性結(jié)腸炎，可產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素。EHCOO157：O26、OⅢ等。附：腸出血性大腸桿菌O157:H7介紹。此外，腸粘附性大腸桿菌〔EnteroadhesiveE.coli,EAEC〕也可引起腹瀉，EAECLTST，也無VT毒素。唯一特征是具有與Hep-2細(xì)胞〔人喉上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系〕粘附的Hep-2表：引起急性腹瀉的大腸桿菌小腸小腸菌大腸菌大腸水瀉水瀉痢疾樣血性腹瀉嬰兒，成人嬰兒成人，兒童各種年齡世界各地世界各地北美、日本散發(fā)或爆發(fā)，常童起散發(fā)性或暴炎致病機(jī)理LT、ST細(xì)胞毒素侵襲腸粘膜細(xì)胞細(xì)胞毒素2829112124、136、143、144、O157：H7152、164、167鑒定測定LT、ST、檢出定居因子血清型血清型與臨床表現(xiàn)血清型測定細(xì)菌侵襲力血清型群分布進(jìn)展中國家(熱帶)世界各地流行病散發(fā)或爆發(fā)嬰兒腹散發(fā)或爆發(fā)嬰兒腹學(xué)瀉及旅游者腹瀉瀉定居因子定居因子O6、8、15、20、25、26445586、114119125、血清型27、78、148、159126127128142、146、158大腸桿菌的檢驗(yàn)方法SN0169—92GB/T4789.6—1994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)SN樣品制備：225mL8000r/min1～2min1:10稀釋樣品勻液依據(jù)對樣品污染狀況的估量,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列15min。9MPNMPNLSTEC對每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三1mL36±1℃48±2h。3mm48±2hLSTECEC30min44.5±0.5℃48±2h。附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？EMB(EMB)平板,36±1℃24±2h。檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2脂斜面上,36±1℃18～24h。附：怎樣進(jìn)展平板劃線分別？平板劃線例如EMB生化試驗(yàn)：將斜面培育物移種到以下培育基中進(jìn)展生化試驗(yàn)。24±2hKovacs0.2～0.3mL,上層消滅紅色為靛基質(zhì)陽性反響。附：靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片MR-VP36±1℃48±2h1mL5％α-0.6mL,40％0.2mL2h,VP48h5滴甲基紅溶液。如培育物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽性,假設(shè)變黃色則為陰性反響。附：MR-VP試驗(yàn)原理及照片Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培育96h記錄有無生長。附：枸椽酸鹽利用試驗(yàn)原理及斜面顯色照片LST：36±1℃48±2h,觀看試管中是否產(chǎn)氣。革蘭氏染色：取18h養(yǎng)分瓊脂斜面培育物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基質(zhì)┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸鹽┃鑒定(型別)━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃＋┃－┃－┃典型大腸桿菌－┃＋┃－┃－┃非典型大腸桿菌━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃＋┃－┃＋┃典型中間型－┃＋┃－┃＋┃非典型中間型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━－┃－┃＋┃＋┃典型產(chǎn)氣腸桿菌＋┃－┃＋┃＋┃非典型產(chǎn)氣腸桿菌━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如消滅上表以外的生化反響類型,說明培育物可能不純,應(yīng)重劃線分別,必要時(shí)做大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為＋＋－－或－＋－－,再依據(jù)LSTMPNMPN值。致瀉性大腸桿菌的檢驗(yàn)〔GB方法簡介〕增菌25g，225mL1minMPN，500mL36±1℃6h1130mL42℃18h。分別將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美板，于36±1℃培育18～24h，觀看菌落。不但要留意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要留意乳糖不發(fā)酵和緩慢發(fā)酵的菌落。EMB生化試驗(yàn):自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂蛋白胨水、半固體、pH7.2KCN湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培育基36℃培育過夜。TSIH2S，KCNKCN均非大腸埃希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。附：三糖鐵瓊脂(TSI)原理及照片克氏雙糖鐵瓊脂照片血清學(xué)試驗(yàn)OO157當(dāng)與某一種多價(jià)OOO證明試驗(yàn)：制備OMacFarland31：160～1：320O0.5%1：40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內(nèi)等量混合，做單管凝集試驗(yàn)?；靹蚝蠓庞?0℃水浴16hO附：致瀉性大腸桿菌及O血清。腸毒素試驗(yàn)〔產(chǎn)毒素性大腸桿菌〕〔LT－不耐熱腸毒素，ST－耐熱腸毒素〕酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測LT和ST。雙向瓊脂集中試驗(yàn)檢測LT乳鼠罐胃試驗(yàn)檢測ST附：腸毒素試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、腸毒素試驗(yàn)作出報(bào)告。大腸桿菌O157:H7出血性大腸桿菌O157:H7介紹1、培育基制備：：EC20mg/mL20μg/mL。2.5mg/L，0.05mg/L。0.1g/L。2、增菌培育41±1℃18-243、分別mEC10TC-SMAC36±1℃18~242mm。附：在梅里埃公司改進(jìn)山梨醇麥康凱瓊脂上的菌落。4、鑒定MUG-LST，36±1℃18~24消滅產(chǎn)氣，且無熒光者，分別到一般養(yǎng)分瓊脂。生化試驗(yàn)。5mL100℃分鐘滅活后，供自動酶聯(lián)熒光免疫測試〔VIDAS〕，快速獲得初步結(jié)果，陽性反響者需作進(jìn)一步證明。附:自動酶聯(lián)熒光免疫測試〔mini-VIDAS〕自動酶聯(lián)熒光免疫測試〔VIDAS〕測定程序EHECO157:H725g↓mEC225mL→VIDAS↓41±1℃，18-24h10-4，10-5，10-6TC-SMAC↓36±1℃，18-24h挑取5-10個(gè)可疑菌落接種MUG-LST↓36±1℃，18-24hMUG↓ ↓生化反響鑒定 鑒定或膠乳凝集試驗(yàn)E.coliO157:H7EHECO157:H7O157:H7。VeroHela〔PCR〕檢測法。〔FDA8〕染色技術(shù)〔80-90%以上〕，對光線的吸取和反表其生活細(xì)胞的真實(shí)狀況，染色觀看時(shí)必需留意。本節(jié)包括四局部：二、染料的種類和選擇三、制片和染色的根本程序四、染色方法一、染色的根本原理材料，必需把它們的物理形式加以轉(zhuǎn)變〔如轉(zhuǎn)變pH值〕，才利于吸附作用的發(fā)〔如細(xì)胞質(zhì)〕通常僅能染上酸性染料，假設(shè)把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液染色?；慕M成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。二、染料的種類和選擇蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分簡單，有些至今還未搞清楚。目溶于水，通常制成鹽類。性〔復(fù)合〕染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料pH時(shí)，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。2、堿性染料等，在一般的狀況下，細(xì)菌易被堿性染料染色。3、中性〔復(fù)合〕染料酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性〔復(fù)合〕染料，如瑞脫氏〔Wright〕染料和基姆薩氏〔Gimsa〕染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。4、單純?nèi)玖蟿┲校缱系ゎ悺睸udanb〕的染料。三、制片和染色的根本程序要通過制片及一套染色操作程序。1、制片1或固體培育物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、自然枯燥切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。3、固定標(biāo)本枯燥后即進(jìn)展固定，固定的目的有三個(gè)：１〕殺死微生物，固定細(xì)胞構(gòu)造。２〕保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉?！餐坑袠?biāo)本的遠(yuǎn)端〕，標(biāo)本向上，在3—42—3加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜〔60℃〕,放置待冷后，進(jìn)展染色。1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同1—2把標(biāo)本從培育皿中取出，并使之枯燥。4、染色有時(shí)染色時(shí)還要加熱。染料作用標(biāo)本的時(shí)間平均約1—3分鐘，而全部的染色時(shí)間內(nèi)，整個(gè)涂片〔或有標(biāo)本的局部〕應(yīng)當(dāng)浸在染料之中。料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)展。５、脫色95%3%鹽酸溶液。６、復(fù)染。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最終進(jìn)展染色，就是復(fù)染。７、水洗體吸附的染料則保存。８、枯燥熱烘干，用吸水紙時(shí)，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。９、鏡檢枯燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀看。四、染色方法〔如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等〕特別染色法。食品微生物檢驗(yàn)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。１、單染色法一般狀況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)展單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅PH〔低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)〕，讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。染色結(jié)果依染料不同而不同：石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時(shí)間短，菌體呈紅色。草酸銨結(jié)晶染色液：染色快速，著色深，菌體呈紫色。２、革蘭氏染色法1884Gram蘭氏陽性菌〔G+〕，后者為革蘭氏陰性菌〔G—〕。為觀看便利，脫色后再用一種螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反響。吸附染料差，易脫色