詳細(xì)柱層析技巧

詳細(xì)柱層析技巧常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。

柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。

壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。

減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。

加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的。

關(guān)于柱子的尺寸，應(yīng)該是粗長的最好。

柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費(fèi)）。

現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。

關(guān)于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品。

可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因?yàn)槿軇┖凸枘z飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也是因?yàn)榉蛛x的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因?yàn)槭莝chlenk操作，所以點(diǎn)板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點(diǎn)板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準(zhǔn)備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點(diǎn)，不過幾次之后就知道樣品在哪，也就可以省些了。

像我以無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因?yàn)楣枘z中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機(jī)化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中性和酸性的，選擇余地比較大，但是比硅膠要貴些。

聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗(yàn)證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。

關(guān)于濕法、干法上樣。

濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。

很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生，這就應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。

有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起顯色是

常壓柱色譜，又稱柱層析，是色譜法中最常見的一種。它的突出優(yōu)點(diǎn)是，分離效率比經(jīng)典的化學(xué)分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，更換流動相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級范圍很寬的各種樣品，因此在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中至今仍被廣泛應(yīng)用。

為了保證色譜柱良好的分離效果，色譜柱應(yīng)裝填得盡可能緊密和均勻，在柱中沒有氣泡、裂縫或溝槽，也不發(fā)生柱的徑向或軸向固定相的粒度不均勻分布。傳統(tǒng)常壓色譜柱的填裝分為干法裝柱和濕法裝柱（也稱漿法裝柱）兩種，這兩種方法均存在操作不易掌握、易出現(xiàn)氣泡和裂縫，裝柱時間長等不足之處。本文提出的新的裝柱方法介入干裝法和濕裝法之間，稱之為自然沉降法。

自然沉降法通過對固定相和溶劑的選擇，并輔以新的色譜柱，可對常壓色譜柱進(jìn)行簡便、高效的填裝。用所述裝柱技術(shù)制備的色譜柱對多種未知組成樣品進(jìn)行分離[1]，分離效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)裝柱法。此外，該法裝柱快速，易掌握，不會出現(xiàn)斷層和氣泡等常見問題，裝柱成功率高，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價值

本文所指的柱層析技術(shù)：

1、Flashchromatograph加壓快速過柱

快速過柱，避免了擴(kuò)散的產(chǎn)生，分離效果大大提高。

2、用薄層層析硅膠裝柱，柱層析硅膠干法上樣。上樣高度不超過2-3mm

干法上樣，保證了上樣的均勻性。

3、洗脫劑=展開劑

4、TLC上，二點(diǎn)沒有重疊

假設(shè)：

1、柱層析也有一個Rf值。對上面的柱層析技術(shù)，該Rf值=薄層層板(TLC）的Rf值。

根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，該假設(shè)成立

問題：

設(shè)硅膠高度為h厘米,單位厘米的硅膠體積為s。TLC上有兩個點(diǎn)，x,y,Rf分別為Rf1和Rf2，其中Rf1>Rf2

現(xiàn)在要把上述兩個點(diǎn)分開。請問x什么時候出來，用什么樣的接收瓶能保證把兩個點(diǎn)分開。

解答：

hx=x點(diǎn)出現(xiàn)在柱下方的時候，洗脫劑總共流過的高度

hy=y點(diǎn)出現(xiàn)在柱下方的時候，洗脫劑總共流過的高度

設(shè)硅膠部分含溶劑體積為V,V肯定小于h*s

當(dāng)洗脫劑從柱上方流到柱下方的時候，x點(diǎn)到達(dá)h*Rf1處，y點(diǎn)到達(dá)h*Rf2處。

要讓x點(diǎn)到達(dá)柱下方，其實(shí)就是解下列方程

h/hx=(h*Rf1)/h=Rf1

即：hx=h/Rf1

同理，y點(diǎn)到達(dá)柱下方，洗脫劑需流經(jīng)hy高度,hy=h/Rf2

x,y點(diǎn)相差距離為hy-hx，考慮到他們都有擴(kuò)散，設(shè)其擴(kuò)散半徑相同，都為R

對于快速柱，擴(kuò)散效應(yīng)都不厲害，設(shè)其值為，R=（hy-hx）/4，即假設(shè)他們中間夾著一個同樣大小的中間點(diǎn)

則x,y點(diǎn)實(shí)際相差距離為hy-hx-2R=（hy-hx）/2

所以，當(dāng)接受瓶總共接受到hx*s+V=h/Rf1+V體積的時候，hx開始出現(xiàn)，V<h*s。

如果接受瓶的體積小于(h/rf2-h/rf1)*s/2的時候，可足夠保證分開x和y點(diǎn)，

舉一個例子，如果硅膠高度為h=10cm，單位面積為s=1平方厘米。兩點(diǎn)Rf值分別為0.25,0.2

則，當(dāng)接受瓶總共收集到40ml(10*1/0.25)到50ml(10*1/0.25+10*1）的時候，x點(diǎn)會出現(xiàn)。接受瓶容量為（50-40）/2=5ml的時候，可將兩點(diǎn)分開。

從上面，可以得出下列推論

1、如果Rf越小，則點(diǎn)越晚出來，浪費(fèi)的溶劑越多。

2、如果Rf提高，則相應(yīng)接受瓶的容量應(yīng)小一些。

3、Rf合適的高度，應(yīng)該是在TLC上，兩點(diǎn)之間距離剛好可以容納第三點(diǎn)，這樣，理論上就可以分開這兩點(diǎn)了。

4、上樣高度越薄，則其擴(kuò)散程度越低，分離效果越好。建議高度不超過2-3mm。所以，盡量采用粗柱子

5、硅膠高度越長，則浪費(fèi)的溶