分支桿菌屬細菌檢驗課件

微生物檢驗技術(shù)第八章分枝桿菌屬細菌檢驗.1微生物檢驗技術(shù)第八章分枝桿菌屬細菌檢驗.1目錄第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌第三節(jié)、非典型分枝桿菌

.2目錄第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌.2分枝桿菌屬是一類細長略彎曲的，有分枝生長趨勢的桿菌。本屬細菌的主要特點是細胞壁含有大量脂質(zhì)，因此不易著色，若經(jīng)加熱或延長染色時間而著色后能抵抗3%（強脫色劑)鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌。分枝桿菌屬共性.3分枝桿菌屬是一類細長略彎曲的，有分枝生長趨勢的桿菌。分枝桿菌

緩慢生長菌

迅速生長菌

不能培養(yǎng)菌麻風(fēng)分枝桿菌龜膿腫分枝桿菌群偶發(fā)分枝桿菌……分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌坎納分枝桿菌田鼠分枝桿菌卡介苗鳥分枝桿菌復(fù)合群堪薩斯分枝桿菌戈登分枝桿菌……非結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群迅速生長分菌（RunyonIV群）光產(chǎn)色菌（RunyonI群）暗產(chǎn)色菌（RunyonII群）不產(chǎn)色菌（RunyonIII群）分枝桿菌屬分類.4麻風(fēng)分枝桿菌龜膿腫分枝桿菌群分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核迅速第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌核分枝桿菌簡稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。對人致病的主要有人型、牛型和非洲型分支桿菌。其中人型結(jié)合分支桿菌的發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌經(jīng)多途徑感染，侵入全身多個器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見.5第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌.5三大傳染疾病全球三大傳染疾全球疾全球三大傳染疾病愛滋?。ˋIDS）結(jié)核?。═B）瘧疾（Malaria）結(jié)核病近年來發(fā)病成上升趨勢，已成為危脅人類健康的嚴重的全球性重大公共衛(wèi)生問題結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高，約占90%.6三大傳染疾病全球三大傳染疾全球疾全球三大傳染疾病愛滋?。ˋI案例

患者，女，19歲。就診時主訴：近一個多月來咳嗽，痰中帶有血絲，無胸痛，但又明顯乏力，消瘦，食欲不振，自覺午后微熱，盜汗。查體：體溫38.2℃，慢性病容。實驗室檢查：白細胞8x109/L，血沉70mm/h。X射線透視：右肺尖有多發(fā)性小斑片狀陰影，邊緣模糊。去清晨咳痰進行抗酸染色，鏡下可見紅色略長微彎的桿菌。請問：1.患者可能患何種疾??？引起本病的病原體是什么？2.應(yīng)做哪些微生物學(xué)檢查已確診？.7案例患者，女，19歲。知識鏈接結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO報道，每年約有800萬-1000萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。.8知識鏈接結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO報道，每年約有8一、生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色

菌體細長略彎曲，呈單、分支狀、束狀、索狀排列的桿菌。無芽胞、無鞭毛、有莢膜。革蘭染色陽性，但不易著色。常用萋尼抗酸染色后菌體呈紅色。萋～尼氏抗酸性染色法染色，菌體染成紅色熒光染料金胺O染色，在熒光下菌體呈橘黃色.9一、生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色萋～尼氏抗酸性染色法染色，菌體染2.培養(yǎng)特性饞:專性需氧,營養(yǎng)要求高（L-J培養(yǎng)基）懶:生長溫度35℃,生長緩慢,18小時繁殖一代丑:液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生長,固體培養(yǎng)基上形成形似菜花樣典型菌落.102.培養(yǎng)特性饞:專性需氧,營養(yǎng)要求高（L-J培養(yǎng)基）.103、生化反應(yīng)1）生化反應(yīng)不活潑。不發(fā)酵糖類。2）熱觸酶試驗對區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌有重要意義。結(jié)核分枝桿菌大多數(shù)觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性；非結(jié)核分枝桿菌則大多數(shù)兩種試驗均陽性。3）與牛分枝桿菌的區(qū)別在于結(jié)核分枝桿菌可合成煙酸和還原硝酸鹽，而牛分枝桿菌不能。.113、生化反應(yīng).11“三耐三不耐”對某些理化因子的抵抗力較強：耐干燥耐酸堿耐染料濕熱紫外線酒精4.抵抗力不耐受.12“三耐三不耐”4.抵抗力不耐受.12典型形態(tài)→多形性R型菌落→S型菌落有毒→無毒（卡介苗）抗結(jié)核藥敏感→耐藥5、變異性卡介苗：是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油、膽汁和馬鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒變異株.13典型形態(tài)→多形性5、變異性卡介苗：是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)：磷脂

索狀因子

蠟質(zhì)D硫酸腦苷酯

蛋白質(zhì)莢膜1、致病物質(zhì)尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由菌體成分導(dǎo)致的炎癥和免疫損傷引起病變主要致病物質(zhì)二、臨床意義.14脂質(zhì)：磷脂1、致病物質(zhì)尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主2.所致疾病2、所致疾病※結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見?！Y(jié)核分支桿菌可經(jīng)淋巴-血液播散，引起腦結(jié)核、腎結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎等.152.所致疾病2、所致疾病.153.免疫性抗體無保護作用，臨床輔助診斷有意義。細胞免疫發(fā)揮重要抗感染作用TB菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低?？菇Y(jié)核的免疫稱為有菌免疫，菌體及其成分消失，免疫力也隨之消失.163.免疫性抗體無保護作用，臨床輔助診斷有意義。細胞免疫發(fā)揮重4、結(jié)核菌素試驗結(jié)核菌素即結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)，目前常用結(jié)核菌素制劑是純蛋白衍生物（PPD）1）原理：結(jié)核菌素試驗是應(yīng)用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗2）試驗方法與意義：受試者前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射PPD5U，48～72h后，觀察結(jié)果。.174、結(jié)核菌素試驗.173）結(jié)果及意義：紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，≥15mm為強陽性，對臨床診斷有意義。若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。4）用途：①選擇卡介苗的接種對象和測定接種效果；②輔助診斷嬰幼兒結(jié)核?。虎墼诹餍胁W(xué)中，作為調(diào)查人群感染結(jié)核桿菌的一個指標(biāo)；④測定腫瘤患者的細胞免疫功能。.183）結(jié)果及意義：紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，≥15mm為強陽結(jié)核菌素試驗純蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥根據(jù)注射部位是否出現(xiàn)紅腫判斷結(jié)果＜5mm為陰性＞5mm為陽性48小時后.19結(jié)核菌素試驗純蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核分枝三、微生物檢查1、標(biāo)本采集：根據(jù)病變部位不同采集不同的標(biāo)本。常見標(biāo)本為痰、尿、胸腹水等。1）痰：留取清晨第一口痰3-5ml。合格的痰標(biāo)本應(yīng)使患者深吸氣后，由肺部深處一干咳痰、血痰或黏液痰為合格標(biāo)本。用WHO推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶，或用密封塑料盒、蠟紙盒收集后送檢。2）其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液等盛無菌試管送檢。腦脊液標(biāo)本靜置后，表面可有細薄凝塊，取凝塊作涂片或接種培養(yǎng).20三、微生物檢查1、標(biāo)本采集：根據(jù)病變部位不同采集不同的標(biāo)本。臨床標(biāo)本

涂片檢查

分離培養(yǎng)

HPLC分子鑒定免疫學(xué)鑒定直接涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動物試驗

（L-J培養(yǎng)基）抗酸..金胺O..

35℃涂片鏡檢儀器培養(yǎng)

＜7天生長＞7天生長快速生長菌慢生長菌初步鑒定

抗酸染色菌落特點鑒定試驗藥敏試驗2、檢驗程序.21臨床標(biāo)3、檢驗方法（1）抗酸染色鏡檢1）直接涂片①薄涂片：0.01ml，10mmX10mm,②厚涂片：0.1ml，20mmX15mm2）集菌涂片：將標(biāo)本濃集后再涂片，提高陽性檢出率①沉淀集菌法；②漂浮集菌法（2）熒光染色鏡檢：用金胺O染色，在暗背景下，抗酸桿菌發(fā)出熒光（優(yōu)點：簡便、快速、視野覆蓋面大和陽性率檢出高）

.223、檢驗方法.22結(jié)核分枝桿菌痰涂片抗酸染色（×1000）.23結(jié)核分枝桿菌痰涂片抗酸染色（×1000）.23（3）分離培養(yǎng)1）培養(yǎng)基選擇：通常使用的固體培養(yǎng)基有改良羅氏（L-J）培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、米氏7H10和7H11，液體培養(yǎng)基有米氏7H9和蘇通氏培養(yǎng)基。2）標(biāo)本的前處理：前處理的目的：一是殺死雜菌，二是液化標(biāo)本。常見的方法：①40g/LNaOH法：1份痰+2份40g/LNaOH溶液，35℃水浴消化15-30分鐘，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種②4%H2SO4法：多用于尿標(biāo)本的前處理，1份標(biāo)本+2-4倍4%H2SO4，室溫20min，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種③胰酶-苯扎溴銨法.24（3）分離培養(yǎng).243）接種與培養(yǎng)取堿處理過的標(biāo)本，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上酸處理過的標(biāo)本則接種在改良羅氏培養(yǎng)基斜面上4）結(jié)果：①3天內(nèi)有菌落生長，可報告非分枝桿菌生長。②7天內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)過抗酸染色證實后可報告快速生長抗酸桿菌。7天以后發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)過抗酸染色證實后可報告抗酸桿菌生長。③滿8周后仍未見菌落生長者可報告培養(yǎng)陰性。（4）鑒定：依據(jù)生化反應(yīng)鑒定（5）動物實驗（6）其他診斷技術(shù).253）接種與培養(yǎng).25抗酸染色（×1000）結(jié)果報告

－0／300視野

±

1～2條／300視野＋1～9條/100視野

2＋1～9條/10視野

3＋1～9條/每個視野

4＋>9/每個視野.26抗酸染色（×1000）結(jié)果報告－0／30第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌是麻風(fēng)病的病原菌。麻風(fēng)是一種慢性傳染病。主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫.27.27.28.28.29.291、形態(tài)與染色較結(jié)核桿菌粗而短，抗酸染色陽性，呈束狀或團狀排列，革蘭陽性，無鞭毛、莢膜和芽胞。典型細胞內(nèi)寄生菌，可形成麻風(fēng)細胞（即有麻風(fēng)桿菌存在、呈泡沫狀的細胞）2、培養(yǎng)特性：目前不能人工培養(yǎng)，可用動物犰狳（qiuyu）接種建立模型。一、生物學(xué)特性.301、形態(tài)與染色較結(jié)核桿菌粗而短，抗酸染色陽性，呈束狀或團.31.31.32.32.33.33二、臨床意義傳染源：麻風(fēng)患者傳播途徑：直接接觸、飛沫傳播易感人群：多為免疫缺陷個體3種臨床類型:1)瘤型麻風(fēng)：傳染性強且病情嚴重，細胞免疫功能缺陷而體液免疫正常。在皮膚和黏膜下形成結(jié)節(jié)性紅斑，稱為麻風(fēng)結(jié)節(jié)。面部結(jié)節(jié)融合可呈“獅面”狀。2）結(jié)核樣型麻風(fēng)3）界線類綜合征.34二、臨床意義傳染源：麻風(fēng)患者.34根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型、界線綜合征兩種病型結(jié)核樣型麻風(fēng)患者手部病變體征.35根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié).36.36第三節(jié)、非典型分支桿菌非典型分枝桿菌分為光產(chǎn)色菌（I群）、暗產(chǎn)色菌（II群）、不產(chǎn)色菌（III群）和速生菌（IV群）4群。廣泛分布在自然界，致病性較弱，可寄居與人體。當(dāng)機體抵抗力低下時，可導(dǎo)致肺內(nèi)、外或淋巴結(jié)類似結(jié)核的病變。特點結(jié)核分枝桿菌非典型分支桿菌菌落特征粗糙、顆粒狀光滑或粗糙菌落顏色乳白色或米白色黃色或橘黃色耐熱觸酶試驗-+中性紅試驗+-索狀因子++/-豚鼠致病性+-.37第三節(jié)、非典型分支桿菌.37本章小結(jié)分枝桿菌屬的細菌因其細胞壁富含脂質(zhì)，經(jīng)加溫或延遲染色時間后能抵抗一定濃度鹽酸乙醇的脫色作用，故稱抗酸桿菌。該屬細菌培養(yǎng)時專性需氧，營養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長緩慢，其中的麻風(fēng)分枝桿菌目前尚不能人工培養(yǎng)。該屬細菌中臨床最常見的是結(jié)核分枝桿菌，該菌經(jīng)萋–尼抗酸染色后呈紅色，用熒光染料金胺O染色后，在熒光顯微鏡下菌體發(fā)出黃綠色熒光。結(jié)核分枝桿菌常用羅–琴培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該菌在羅–琴培養(yǎng)基上生長緩慢，一般2～4周才能形成肉眼可見菌落，菌落外觀類似“菜花樣”；在液體培養(yǎng)基中生長較為迅速，一般1～2周即可生長，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束狀生長