色譜分析法課件

第六章色譜分析法第六章色譜分析法1內(nèi)容TLCGCHPLC內(nèi)容TLC2第一節(jié)薄層色譜法定性

常作為監(jiān)測(cè)手段定量

薄層掃描制備薄層色譜制備代謝產(chǎn)物常用第一節(jié)薄層色譜法定性3第二節(jié)氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)：具有分離和分析兩種功能，選擇性好、靈敏度高、用樣量少、分析速度快和應(yīng)用范圍廣。適用：生物樣品中具有一定揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的藥物及其代謝物的分離測(cè)定。（可衍生化）一、概述第二節(jié)氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)：具有分離和分析兩種功能，選擇性好、一4二、儀器簡(jiǎn)介載氣進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器記錄裝置二、儀器簡(jiǎn)介載氣進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器記錄裝置51.載氣（流動(dòng)相）：

常用高純氮，其他：氦氣、氫氣、氬氣。2.進(jìn)樣：

1）氣體進(jìn)樣、液體進(jìn)樣2）進(jìn)樣室溫度一般等于或高于柱溫，以便注入的樣品能瞬間揮發(fā)。3.色譜柱：

由柱管和管內(nèi)的固定相組成。柱管材料通常用不銹鋼或玻璃組成。生物樣品分析中通常采用玻璃柱。原因：（1）近于惰性，不會(huì)引起被測(cè)組分熱催化分解。（2）還可先經(jīng)硅烷化處理后再裝填固定相，能降低管壁對(duì)藥物的吸附。常用一般填充柱和毛細(xì)管柱兩類(lèi)。毛細(xì)管柱又分為填充毛細(xì)管柱和開(kāi)口毛細(xì)管柱。1.載氣（流動(dòng)相）：64.常用檢測(cè)器

（1）氫火焰離子化檢測(cè)器：（hydrogenflameionizationdetector,FID）

體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用最廣泛，凡是能在氫-空氣火焰中電離的有機(jī)藥物及其代謝物都能被檢測(cè)出來(lái)，而無(wú)機(jī)藥物與惰性氣體對(duì)該檢測(cè)器均不產(chǎn)生電信號(hào)。（2）氮-磷檢測(cè)器(nitrogenphosphorusdetector,NPD)

堿焰離子化檢測(cè)器(AFID)對(duì)氮和磷敏感。（3）電子捕獲檢測(cè)器(electroncapturedetecor,ECD)

是一種有選擇性的高靈敏度的檢測(cè)器。主要用于測(cè)定含有鹵素或含有-CONH2、-CN、-ONO、-NO2等吸電子基因的有機(jī)藥物。（4）質(zhì)譜檢測(cè)器(massspectrometrydetector,MSD)

用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。4.常用檢測(cè)器（1）氫火焰離子化檢測(cè)器：7三、定量分析方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)理論板數(shù)，分離度，重復(fù)性，拖尾因子內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法三、定量分析方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)8四、頂空分析法生物樣品一般不能直接用GC法分析，原因：1、水分的影響。2、大多內(nèi)源性成分揮發(fā)性很低，沉結(jié)柱頭，損壞色譜柱。因此一般需萃取，純化后進(jìn)樣。少數(shù)情況下，被測(cè)組分揮發(fā)性強(qiáng)，可用頂空分析法。四、頂空分析法生物樣品一般不能直接用GC法分析，原9頂空分析法：（又稱(chēng)液上氣相色譜分析法）不經(jīng)過(guò)萃取直接分析的方法生物樣品中僅用于測(cè)定揮發(fā)性強(qiáng)或低沸點(diǎn)的藥物，如血中的醇、醛以及某些麻醉氣體，或一些揮發(fā)性強(qiáng)的內(nèi)源性成分。如：尿中的三甲胺。必要條件：被測(cè)組分在測(cè)定溫度下有足夠高的蒸氣壓例：血中乙醇濃度測(cè)定頂空分析法：（又稱(chēng)液上氣相色譜分析法）生物樣10內(nèi)標(biāo)方法：樣品（血液）和內(nèi)標(biāo)（丙醇）加入樣品瓶，60℃水浴30min后，用注射器直接抽取瓶?jī)?nèi)液面上的氣體5ml，迅速注入氣相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。由于直接測(cè)定的是與液體樣品平衡的氣體，因此，又稱(chēng)為液上氣相色譜分析。內(nèi)標(biāo)方法：樣品（血液）和內(nèi)標(biāo)（丙醇）加入樣品瓶，60℃水浴311五、衍生化方法制備衍生化的目的：①增加被測(cè)組分的熱穩(wěn)定性；②增加被測(cè)組分的揮發(fā)性；③減少被測(cè)組分在樣品制備過(guò)程中因吸附性強(qiáng)導(dǎo)致的損失；④改善組分的層析行為，即制備成衍生物之后易于同其他組分分開(kāi)；⑤增加被測(cè)組分對(duì)有關(guān)檢測(cè)器的靈敏度和選擇性。五、衍生化方法12

第三節(jié)高效液相色譜法儀器簡(jiǎn)介常用色譜分離方法及其應(yīng)用

反相液－液分配色譜離子對(duì)色譜制備高效液相色譜直接進(jìn)樣分析法

手性藥物的高效液相色譜法定量分析方法第三節(jié)高效液相色譜法儀器簡(jiǎn)介13一、儀器簡(jiǎn)介貯液瓶泵進(jìn)樣器過(guò)濾器色譜柱檢測(cè)器記錄裝置廢液高效液相色譜儀示意圖一、儀器簡(jiǎn)介貯液瓶泵進(jìn)樣器過(guò)濾器色譜柱檢測(cè)器記錄裝置廢液高效14色譜分析法ppt課件15色譜分析法ppt課件16色譜分析法ppt課件171.流動(dòng)相流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)：（1）盡量選用純度高的溶劑，以保證良好的分離效果和較小的基線(xiàn)本底。試劑的級(jí)別：色譜純；水：重蒸水（2）濾除不溶性顆粒，以保護(hù)泵和色譜柱。過(guò)濾：0.45μm的微孔濾膜（水膜、有機(jī)膜）（3）脫氣，以保持基線(xiàn)穩(wěn)定。（有氣泡，柱壓不穩(wěn)，基線(xiàn)起伏）方法：超聲或過(guò)濾（4）混合均勻（脫氣可達(dá)到此目的）（5）pH應(yīng)符合色譜柱的要求，否則柱床破壞，柱壽命縮短。1.流動(dòng)相流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)：（1）盡量選用純度高的溶劑，以182.高壓泵（輸液泵）可用于控制流速，流速過(guò)高，柱壓高3.進(jìn)樣進(jìn)樣器進(jìn)樣閥流動(dòng)相樣品流動(dòng)相2.高壓泵（輸液泵）可用于控制流速，流速過(guò)高，柱壓高3.進(jìn)樣194.色譜柱分離的核心部分(1)色譜柱的分類(lèi)類(lèi)型不同，填料不同藥物分析中，多用硅氧烷型化學(xué)鍵合固定相極性鍵合固定相：氨基、氰基鍵合相，分析極性、中等極性藥物

中等極性鍵合固定相：醚基鍵合相，分析中等極性、弱極性藥物非極性鍵合固定相：十八烷基鍵合相，分析非極性、弱極性藥物4.色譜柱分離的核心部分(1)色譜柱的分類(lèi)20（2）色譜柱的維護(hù)A、樣品和流動(dòng)相中要除去大分子雜質(zhì)和顆粒，尤其是樣品中的蛋白質(zhì)。以免柱頭阻塞，柱子壽命縮短。B、流動(dòng)相的pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。（必須）C、用無(wú)機(jī)緩沖液做流動(dòng)相后，應(yīng)先用水沖洗，再用甲醇沖洗。（注意：一般C18色譜柱不宜用純水沖洗，可用含低濃度甲醇水沖洗）D、長(zhǎng)期使用后柱效降低，可照說(shuō)明書(shū)依次用不同濃度的溶劑沖洗，使柱子再生。（2）色譜柱的維護(hù)A、樣品和流動(dòng)相中要除去大分子雜質(zhì)和顆粒，21E、使用預(yù)柱（保護(hù)柱），主要用以吸附流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)，以防分析柱被污染，延長(zhǎng)分析柱的壽命。F、每次停止使用時(shí)，都要清洗柱子。長(zhǎng)期保存時(shí)，柱子中要有合適的溶劑（甲醇或乙腈），避免填料干燥。E、使用預(yù)柱（保護(hù)柱），主要用以吸附流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)，以225.檢測(cè)器（1）紫外檢測(cè)器：應(yīng)用最廣泛，適用于有紫外吸收的藥物，靈敏度高，對(duì)環(huán)境溫度及流速波動(dòng)不太敏感，適用于梯度洗脫。A、固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：只能在一個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)定，一般為254nm。B、可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器：190～700nm范圍內(nèi)均可測(cè)定，應(yīng)用最多。C、二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）：可在一秒鐘內(nèi)完成一次從200～800nm波長(zhǎng)范圍的連續(xù)掃描，因此可同時(shí)獲得樣品的色譜圖（用于定量）和每個(gè)色譜組分的光譜圖（定性，鑒別色譜峰純度）。5.檢測(cè)器（1）紫外檢測(cè)器：應(yīng)用最廣泛，適用于有紫外吸收的藥23三維示意圖三組分混合物的三維圖三維示意圖三組分混合物的三維圖24（2）熒光檢測(cè)器（FD）比紫外檢測(cè)器有更高的靈敏度和選擇性。檢測(cè)限可達(dá)10-10g/ml，只適用于能產(chǎn)生熒光或能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌锏乃幬?。?）電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）包括：電導(dǎo)檢測(cè)器、極譜檢測(cè)器、安培檢測(cè)器（AD）AD：適用于具有氧化還原性質(zhì)的化合物的檢測(cè)。檢測(cè)限可達(dá)10-12g/ml。

工作原理：利用組分的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流的變化而進(jìn)行檢測(cè)。（2）熒光檢測(cè)器（FD）比紫外檢測(cè)器有更高的靈敏度和選擇25（4）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）工作原理：攜帶組分的流動(dòng)相蒸發(fā)室流動(dòng)相蒸去樣品組分氣溶膠檢測(cè)室強(qiáng)光或激光散射光散射光強(qiáng)濃度信號(hào)（4）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）工作原理：攜帶組分的流動(dòng)相26質(zhì)量型檢測(cè)器，其色譜峰的面積只與峰中所含物質(zhì)的質(zhì)量有關(guān)。通用型檢測(cè)器，能測(cè)定所有化合物，與化合物的物理、化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)。適用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相樣品的組分。靈敏度較低，尤其是對(duì)紫外吸收的樣品。故主要用于測(cè)定一些沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)，如氨基酸、糖類(lèi)、磷脂、甾體等。注意：流動(dòng)相必須具揮發(fā)性，如甲醇－水、乙腈－水。不能用含無(wú)機(jī)緩沖液的流動(dòng)相，若調(diào)pH值可用NH3－H2O，CH3COOH等。特點(diǎn)：質(zhì)量型檢測(cè)器，其色譜峰的面積只與峰中所含物質(zhì)的質(zhì)27二、常用色譜分離方法及其應(yīng)用HPLC1.液－固吸附色譜（LSC）2.液－液分配色譜（LLC）3.離子交換色譜（IEC）4.空間排阻色譜（SEC）5.親和色譜（AC）6.假相色譜法（PPC）7.手性色譜法（CC）8.毛細(xì)管電泳法（CE）膠束色譜（MC）環(huán)糊精色譜（CDC）膠束色譜（MC）凝膠滲透色譜（GPC）凝膠過(guò)濾色譜（GFC）一般IEC離子色譜（IC）氨基酸分析（AAA）正相LLC（NLLC）反相LLC（RLLC）一般RLLC離子對(duì)色譜（IPC）離子抑制色譜（ISC）鍵合相色譜（BPC）二、常用色譜分離方法及其應(yīng)用HPLC1.液－固吸附色譜（LS28液－液分配色譜利用樣品組分在兩種不相溶的液體（流動(dòng)相和涂漬在載體上的固定相）間的溶解度或分配系數(shù)的差異來(lái)進(jìn)行分離。按照固定相和流動(dòng)相的極性差別，液－液分配色譜分為正相色譜（NP－HPLC）和反相色譜（RP－HPLC）。NP－HPLC：流動(dòng)相極性小于固定相極性RP－HPLC：流動(dòng)相極性大于固定相極性液－液分配色譜利用樣品組分在兩種不相溶的液體（29RP－HPLCNP－HPLC固定相極性流動(dòng)相極性組分流出順序流動(dòng)相極性增加時(shí)低（非極性）高高低極性高的組分先流出極性低的組分先流出保留時(shí)間增加保留時(shí)間縮短RP－HPLCNP－HPLC固定相極性流動(dòng)相極性組分流出順序30RP－HPLC（體內(nèi)藥分中應(yīng)用廣泛）最常用的固定相：十八烷基硅烷鍵合相（ODS或C18）最常用的流動(dòng)相組成：甲醇－水、乙腈－水。四氫呋喃、有機(jī)酸、緩沖鹽。優(yōu)點(diǎn)：1.可將含水體液樣品直接進(jìn)樣或只經(jīng)簡(jiǎn)單去蛋白處理后進(jìn)樣，簡(jiǎn)化操作。尤其適用于測(cè)定含有極性藥物或代謝物的體液樣品。2.體液中內(nèi)源性雜質(zhì)多數(shù)為極性大的化合物，往往先于藥物流出色譜柱，色譜圖上這些雜質(zhì)峰出峰較早，減少了對(duì)藥物峰的干擾，且有利于及時(shí)再進(jìn)樣。RP－HPLC（體內(nèi)藥分中應(yīng)用廣泛）最常用的固定相：十八烷基31制備高效液相色譜法用高效液相色譜法分離制備、純化樣品組分的方法。制備型色譜柱：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)徑20－40mm，長(zhǎng)10－30cm1、分離條件的選擇：固定相：與分析型色譜柱相同，但粒徑較大。流動(dòng)相：等度洗脫(分段)，溶劑純度高，易揮發(fā)。流速：與分析柱比，流速大，目的是為了與分析柱維持相同的保留時(shí)間一般原則：流量之比是柱內(nèi)徑之比的平方。制備高效液相色譜法用高效液相色譜法分離制備、純化樣品組分的方322、上樣量的影響質(zhì)量超載：脫尾，保留時(shí)間縮短。體積超載：平頭峰，半峰寬等于柱頭樣品寬度。質(zhì)量體積都超載：平頭、脫尾樣品溶液不能過(guò)濃，否則出現(xiàn)局部超載；溶劑強(qiáng)度不能超過(guò)流動(dòng)相強(qiáng)度，否則破壞色譜柱內(nèi)平衡。2、上樣量的影響質(zhì)量超載：脫尾，保留時(shí)間333、檢測(cè)器的選擇非破壞性、線(xiàn)性響應(yīng)范圍寬、靈敏度要求不高。4、分離樣品組分收集餾分收集器：自動(dòng)、手動(dòng)。與檢測(cè)器的連接管路不能太長(zhǎng)。與相鄰色譜峰重疊部分可進(jìn)行再循環(huán)3、檢測(cè)器的選擇非破壞性、線(xiàn)性響應(yīng)范圍寬、靈敏度要求不高。434（四）直接進(jìn)樣分析法

測(cè)定生物樣本時(shí)一般通過(guò)預(yù)處理，從而達(dá)到分離純化，濃集，易于測(cè)定等目的。隨著反相高效液相色譜的廣泛應(yīng)用以及近年來(lái)固相萃取技術(shù)和柱切換技術(shù)的發(fā)展，直接進(jìn)樣分析在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用日益增加。（一）直接進(jìn)樣與沉淀蛋白進(jìn)樣直接進(jìn)樣：用于反相HPLC，樣品濃度足夠大，達(dá)到檢測(cè)靈敏度；且含蛋白質(zhì)量極微，不會(huì)污染堵塞色譜柱。如：尿液。（四）直接進(jìn)樣分析法測(cè)定生物樣本時(shí)一般通過(guò)預(yù)處理35簡(jiǎn)單除蛋白后進(jìn)樣：血清、血漿。蛋白沉淀劑：甲醇、乙腈、三氯醋酸等。缺點(diǎn)：使樣品稀釋?zhuān)m用于濃度大的生物樣品。適用于：藥物或代謝物極性很大，難于用有機(jī)溶劑提取時(shí)。（二）柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)是指用閥來(lái)改變流動(dòng)相走向及流動(dòng)相系統(tǒng)，使洗脫液在特定的時(shí)間內(nèi)從預(yù)處理柱切換到分析柱上的一種技術(shù)。簡(jiǎn)單除蛋白后進(jìn)樣：血清、血漿。缺點(diǎn)：使樣品稀釋?zhuān)m用于濃度大36色譜分析法ppt課件371、柱切換高效液相色譜法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用（1）樣品沉淀蛋白后進(jìn)樣樣品中加入蛋白沉淀劑（甲醇、乙腈、三氯醋酸）去蛋白后，將上清液大容量進(jìn)入預(yù)處理柱（短、粒徑小5－10μm），組分保留在預(yù)處理柱上，雜質(zhì)被沖掉，從而起到凈化濃縮的作用。注意：預(yù)處理流動(dòng)相應(yīng)選擇水或適當(dāng)濃度有機(jī)溶劑的水溶液，以便使被測(cè)組分被保留。且沉淀蛋白后的上清液需加入適當(dāng)體積的水稀釋?zhuān)越档陀袡C(jī)溶劑的濃度，防止被測(cè)組分在凈化過(guò)程中從預(yù)處理柱上被洗脫。1、柱切換高效液相色譜法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用（1）樣品沉淀38（2）體液直接進(jìn)樣（在線(xiàn)去蛋白）在以水為主的預(yù)處理流動(dòng)相的引導(dǎo)下，可將大體積的體液樣品直接進(jìn)入預(yù)處理柱（短、粒徑大25－40μm），在水沖洗下除去蛋白質(zhì)和一些極性?xún)?nèi)源性雜質(zhì)，被測(cè)組分則保留在預(yù)處理柱上，得到凈化和濃縮；然后切換，以分析流動(dòng)相將被測(cè)組分從預(yù)處理柱沖至分析柱，進(jìn)行再分離測(cè)定。（3）全血或組織勻漿直接進(jìn)樣關(guān)鍵是預(yù)處理柱必須使用粗粒徑的固相填料（50－90μm）和較大孔徑的柱濾板，以便使血細(xì)胞易于通過(guò)預(yù)處理柱。（2）體液直接進(jìn)樣（在線(xiàn)去蛋白）在以水為主的39（4）其他在線(xiàn)透析、在線(xiàn)衍生化等2、柱切換HPLC的主要優(yōu)點(diǎn)（1）使液－固提取技術(shù)與HPLC分析技術(shù)結(jié)合，具有樣品制備和樣品測(cè)定雙重功能。（2）樣品前處理簡(jiǎn)單且自動(dòng)化（3）被測(cè)樣品組分富集提高了檢測(cè)靈敏度（4）精密度高（4）其他在線(xiàn)透析、在線(xiàn)衍生化等2、柱切換HPLC的主要優(yōu)點(diǎn)40(五)手性藥物的高效液相色譜法1.概述

對(duì)映異構(gòu)體：空間結(jié)構(gòu)不能重疊，互為鏡像關(guān)系的立體異構(gòu)體。相應(yīng)的藥物稱(chēng)為手性藥物。為什么必須對(duì)手性藥物進(jìn)行研究：（1）實(shí)際上是不同的化合物，它們與體內(nèi)的大分子的不同立體結(jié)構(gòu)結(jié)合，可產(chǎn)生不同的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程，從而導(dǎo)致藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化。（2）可能具有不同的藥理和毒理作用，甚至產(chǎn)生藥效拮抗，也可能其中一個(gè)對(duì)映體導(dǎo)致藥物的不良反應(yīng)。例：沙利度胺。(五)手性藥物的高效液相色譜法412.HPLC分離手性藥物的方法（1）間接法：柱前衍生化法定義：是藥物對(duì)映體在用HPLC分離前，先與具有高光學(xué)純度的手性衍生化試劑（CDR）反應(yīng)，在藥物對(duì)映體中引入另一個(gè)手性中心，形成非對(duì)映異構(gòu)體，再以常規(guī)HPLC法進(jìn)行測(cè)定。（2）直接法①手性流動(dòng)相法（CMP）是在流動(dòng)相中加入手性添加劑，使其與待測(cè)物形成非對(duì)映異構(gòu)體復(fù)合物。根據(jù)其形成復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)不同而獲得分離。②手性固定相法（CSP）是在色譜柱的擔(dān)體加上高光學(xué)純度的手性異構(gòu)體而成，從而達(dá)到分離手性異構(gòu)體的目的。2.HPLC分離手性藥物的方法（1）間接法：柱前衍生化法42三、定量分析方法XY藥物濃度X，樣品響應(yīng)值Y1、藥物濃度X是藥物標(biāo)準(zhǔn)品在生物基質(zhì)中的濃度2、響應(yīng)值Y常用內(nèi)標(biāo)法中藥物與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值峰高：峰銳、對(duì)稱(chēng)，對(duì)分離度要求不高峰面積：峰寬，分離度要求較嚴(yán)，不要求對(duì)稱(chēng)三、定量分析方法XY藥物濃度X，樣品響應(yīng)值Y1、藥物濃度X是43（一）外標(biāo)法（常用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法）色譜峰響應(yīng)值－－－生物基質(zhì)中藥物濃度峰高或峰面積生物基質(zhì)中藥物對(duì)照品濃度樣品中藥物的濃度藥物的響應(yīng)值（一）外標(biāo)法（常用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法）色譜峰響應(yīng)值－－－生物基質(zhì)中藥44應(yīng)用外標(biāo)法的基本條件：所有樣品（標(biāo)準(zhǔn)樣品和供測(cè)樣品）中的藥物，必須全部或以相同比例量表現(xiàn)為響應(yīng)值欲滿(mǎn)足次條件必須注意:1、樣品預(yù)處理中各步操作必須完全平行一致（保證藥物回收率一致）2、進(jìn)樣量相等RP－HPLC法應(yīng)用較多，尤其是直接進(jìn)樣或簡(jiǎn)單除蛋白處理后進(jìn)樣。應(yīng)用外標(biāo)法的基本條件：所有樣品（標(biāo)準(zhǔn)樣品和供45（二）內(nèi)標(biāo)