微生物菌種常規(guī)保藏技術規(guī)程

制定本規(guī)程是為實現微生物菌種資源保藏管理程序的規(guī)范化，以有效地保護微生物資源，更好地實現微生物菌種資源的社會共享。微生物菌種資源保藏管理規(guī)程1范圍本規(guī)程規(guī)定了微生物菌種資源保藏的基本原則、要求，菌種資源的收集、整理、保藏、共享的管理流程。本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏的機構。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本規(guī)程的引用而成為本規(guī)程的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本規(guī)程，然而，鼓勵根據本規(guī)程達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本規(guī)程。GB

19489實驗室生物安全通用要求《病原微生物實驗室生物安全管理條例》《獸醫(yī)實驗室生物安全管理規(guī)范》《中華人民共和國專利法》《中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理辦法》《全國食用菌菌種暫行管理辦法》3定義3.1微生物菌種資源microorganism

resources指可培養(yǎng)的有一定科學意義、具有實際或潛在實用價值的古菌、細菌、真菌、病毒、細胞株等及其相關信息數據。3.2菌種保藏preservation

of

culture是指將微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定。4基本原則4.1菌種保藏管理旨在對微生物菌種資源進行保護。保藏機構應采取妥善可靠的方法保藏菌種，避免菌種死亡、退化、變異或污染；對相應的菌種信息應及時整理，并歸檔保存。4.2菌種保藏管理應符合國家相關法律法規(guī)。4.3菌種保藏管理應符合環(huán)境保護要求，不能對周圍造成污染和危害。4.4菌種保藏機構應為社會提供微生物菌種資源的共享服務。5.要求5.1保藏機構所保藏菌種的生物危害程度應與其實驗室生物防護水平相適應，實驗室的裝備和管理應符合GB

19489和《病原微生物實驗室生物安全管理條例》的相關規(guī)定。5.2保藏機構應具備菌種長期保藏、復核鑒定、數據庫管理和網絡共享的完備設施。5.3保藏機構應制定嚴格的保藏管理制度和標準化操作規(guī)程。5.4保藏機構的工作人員應經過專業(yè)培訓，具備從事菌種保藏、復核、鑒定和管理維護能力。6菌種資源的收集6.1菌種實物的收集收集的菌種實物應為純培養(yǎng)物。菌種可通過以下途徑收集，必要時應簽署相關協(xié)議：自行分離交換購買接受委托保藏接受贈送6.2菌種信息的收集6.2.1提供者應提供菌株的研究和鑒定材料，據實填寫保藏機構的登記表格，由保藏機構簽收入檔。6.2.2保藏機構應進一步收集和完善菌株的相關信息。7菌種資源的整理7.1菌種的純度檢測具體方法參照《國家自然科技資源平臺微生物菌種純度檢測技術規(guī)程（試行）》。7.2菌種的復核具體方法參照《國家自然科技資源平臺微生物菌種資源復核技術規(guī)程（試行）》。7.3菌種的編號將復核后的菌株進行編號。7.4菌種資源數據整理1）按照國家自然科技資源平臺制定的微生物菌種資源描述規(guī)范對菌株數據進行整理。2）建立菌株的紙質信息和數字化信息檔案并備份。3）檔案應安全存放，注意防潮、防霉、防蟲、防火、防磁和防盜。8菌種資源的保藏8.1菌種保藏1）應針對保藏菌株確定適宜的保藏方法。2）同一菌株應選用兩種或兩種以上方法進行保藏。3）只能采用一種保藏方法的菌株或細胞株必須備份并存放于兩個以上的保藏設備中。4）菌種保藏方法參照相應的標準操作規(guī)程。5）菌種的入庫和出庫應記錄入檔，實行雙人負責制管理。6）重要菌種應異地保存?zhèn)浞?）高致病性病原微生物和專利菌種應由國家指定的保藏機構保藏。8）菌種保藏設施應確保正常運行，設專人負責管理，定期檢修維護。9）菌種保藏設施應有備用電源，防止斷電事故發(fā)生。8.2定期復核保藏機構要定期檢查菌種保藏效果，有污染或退化跡象時，要及時分離純化復壯。每次檢查要有詳細記錄。8.3廢棄物處置廢棄物的處置參照GB

19489的有關規(guī)定執(zhí)行。9菌種資源的共享9.1信息共享9.1.1目錄共享保藏機構應編寫菌種目錄并定期更新出版，目錄的編寫參照《國家自然科技資源平臺微生物菌種目錄編寫規(guī)范（試行）》。9.1.2網絡共享保藏機構應按照國家自然科技資源共享要求，建立菌種資源信息平臺。9.2實物共享9.2.1微生物資源的共享應嚴格按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和《中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理辦法》等相關規(guī)定執(zhí)行。9.2.2專利菌種共享按照《中華人民共和國專利法》的相關規(guī)定執(zhí)行。9.2.3特殊菌種出口需經有關主管部門批準和許可。9.2.4發(fā)放菌株的名稱、編號及使用方信息均應登記。9.2.5發(fā)放菌株的郵寄和包裝應符合《國家自然科技資源平臺一、二類微生物菌（毒）種包裝、運輸和開啟技術規(guī)程（試行）》和《國家自然科技資源平臺三、四類微生物菌（毒）種包裝、運輸和開啟技術規(guī)程（試行）》的有關規(guī)定。9.2.6菌株提供者和使用者需簽署生物材料轉移協(xié)議，明確雙方的責任、權力與義務。微生物菌種常規(guī)保藏技術規(guī)程1范圍本規(guī)程規(guī)定了微生物菌種常規(guī)保藏技術的基本原則和方法。本規(guī)程適用于微生物菌種的常規(guī)保藏工作。2定義本規(guī)程采用下列定義。2.1微生物菌種資源microorganism

resources指可培養(yǎng)的有一定科學意義、具有實際或潛在實用價值的古菌、細菌、真菌、病毒、細胞株等及其相關信息數據。2.2菌種保藏culture

preservation是指將微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定。2.3定期移植保藏法subculturing亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4℃－6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。2.4液體石蠟保藏法preservation

under

liquid

paraffin亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于4℃－15℃進行保存的一種菌種保藏方法。2.5沙土管保藏法sand

preservation亦稱載體保藏法。是指將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4℃－15℃進行保存的一種菌種保藏方法。3.基本原則3.1應針對菌種特性選擇適宜方法進行保藏。3.2應保證菌種保藏的安全性，不能對周圍環(huán)境造成污染和危害。4方法4.1定期移植保藏法見附錄A。4.2液體石蠟保藏法見附錄B。4.3沙土管保藏法見附錄C。A.1適用范圍本方法適用于大多數細菌和真菌。A.2原理低溫條件下保藏可減緩微生物菌種的代謝活動，抑制其繁殖速度，達到減少菌株突變，延長菌種保藏時間的目的。保藏培養(yǎng)基一般含較多有機氮，糖分總量不超過2%，既能滿足菌種培養(yǎng)時生長繁殖的需要，又可防止因產酸過多而影響菌株的保藏。A.3技術要求A.3.1不同菌種應根據要求選擇合適的培養(yǎng)基。A.3.2接種時要求無菌操作，避免染菌。A.3.3保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冷庫、冰箱等的溫度、濕度，各試管的棉塞有無污染現象，如發(fā)現異常應取出該管，重新移植培養(yǎng)后補上空缺。A.3.4大量菌種同時移植時，各菌株的菌號、所用培養(yǎng)基要進行核對，避免發(fā)生錯誤。A.3.5每次移植培養(yǎng)后，應與原保藏菌株和菌株的登記卡片逐個對照，檢查無誤后再存放。A.3.6斜面菌種應保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。A.4方法與步驟A.4.1培養(yǎng)基制備A.4.1.1器皿準備培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，根據不同情況洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。A.4.1.2溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。A.4.1.3調pH值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據要求加稀酸或稀堿調pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。A.4.1.4加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發(fā)水分。A.4.1.5過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝，斜面培養(yǎng)基不宜超過試管高度的四分之一。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。A.4.1.6包扎標記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。A.4.1.7滅菌根據要求將培養(yǎng)基滅菌。滅菌后擺放斜面時，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。A.4.1.8無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗。A.4.2接種A.4.2.1斜面接種A.4.2.1.1點接把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2中央劃線從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃"之"字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。A.4.2.1.4密波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃密"之"字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.1.5挖塊接種法挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。A.4.2.2穿刺接種用直接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。A.4.2.3液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。A.4.3培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。A.4.4保藏A.4.4.1保藏溫度和時間培養(yǎng)好的菌種于4℃－6℃保存，根據要求每3－6個月移植一次。對于某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1－3個月移植一次。A.4.4.2保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%－70%。測量儀表采用毛發(fā)濕度計或干濕球濕度計。A.4.5移植培養(yǎng)將培養(yǎng)物轉接到另一新鮮培養(yǎng)基中，再在適宜條件下培養(yǎng)。A.4.6菌種復壯菌種如有退化，應將退化的菌種引入原來的生活環(huán)境中令其生長繁殖，通過純種分離，在宿主體內生長等方法進行復壯。附錄B液體石蠟保藏法B.1適用范圍本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細菌(如芽孢桿菌屬，醋酸桿菌屬等)和某些絲狀真菌(如青霉屬，曲霉屬等)。B.2原理液體石蠟保藏法可作為定期移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代謝受到抑制，細胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進入，使好氣菌不能繼續(xù)生長，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達到延長菌種保藏時間的目的。B.3技術要求B.3.1菌種培養(yǎng)參照附錄AB.3.2應選用優(yōu)質化學純液體石蠟。B.3.3液體石蠟易燃，在對液體石蠟保藏菌種進行操作時注意防止火災。B.3.4保藏場所應保持干燥，防止棉塞污染。B.3.5保藏期間應定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應及時補充滅菌的液體石蠟。B.4方法與步驟B.4.1液體石蠟將液體石蠟分裝加棉塞，用牛皮紙包好，0.1MPa滅菌30分鐘取出，置40℃恒溫箱蒸發(fā)水分，經無菌檢查后備用。B.4.2斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A，斜面宜短，不超過試管三分之一為宜。B.4.3灌注石蠟無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1厘米左右，使菌體與空氣隔絕。B.4.4保藏將注入石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫(4℃-15℃)干燥處，保藏時間為2-10年不等。B.4.5恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉接一次。附錄C沙土管保藏法C.1適用范圍本方法適用于產孢類放線菌、芽孢桿菌、曲霉屬、青霉屬以及少數酵母如隱球酵母和紅酵母等。不適用于病原性真菌的保藏，特別是不適于以菌絲發(fā)育為主的真菌的保藏。C.2原理干燥條件下微生物菌種代謝活動減緩，繁殖速度受到抑制。此方法可減少菌株突變，延長存活時間。C.3方法與步驟C.3.1沙土管制備將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干或曬干。另取瘦紅土100目過篩,水洗至中性，烘干，按沙∶土=2∶1混合。把混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa滅菌30分鐘，或常壓間歇滅菌3次，每天每次1小時。滅菌后在不同部位抽出若干管，分別加營養(yǎng)肉汁、麥芽汁、豆芽汁等培養(yǎng)基，經培養(yǎng)檢查后無微生物生長方可使用。C.3.2斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A。C.3.3制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3mL-5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL-0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。C.3.4干燥用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器內。C.3.5純培養(yǎng)檢查從做