基因工程 第二章

基因工程第二章第1頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第2頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因的重組與分離，涉及到一系列相互關(guān)連的酶催化反應(yīng),特別是核酸內(nèi)切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA連接酶(1igase)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，才真正使DNA分子的體外切割與連接成為可能。第3頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一、寄主限制與修飾體系（R/M體系）20世紀(jì)60年W.Arber、H.Smith和D.Nathans等首先發(fā)現(xiàn),為此獲得了1978年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎λ(B)修飾E.coliKE.coliBλ(K)修飾(限制)10-4(限制)10-411第4頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月R/M定義：R/M中的限制作用（restriction)是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA（外源DNA）導(dǎo)致噬菌體寄主幅度受到限制的現(xiàn)象R/M中的修飾作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通過甲基化作用得以甲基化，使DNA獲得修飾，從而避免遭自身限制酶的破壞第5頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制與修飾與三個連鎖基因有關(guān)

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶

hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能則是協(xié)助上述兩種酶識別特殊的作用位點(diǎn)。第6頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月寄主的限制與修飾有兩個方面的作用

1、保護(hù)自身的DNA不受限制，2、破壞外源DNA使之迅速降解。細(xì)菌正是利用限制與修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身DNA與外源DNA的。第7頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月二、限制性內(nèi)切酶(RE)限制性內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。EcoRⅠ切割位點(diǎn)第8頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

分類ⅠⅡⅢ酶分子的結(jié)構(gòu)與功能三亞基多功能酶單一功能酶二亞基雙功能酶限制與修飾的新聞系酶蛋白同時具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同時具有甲基化作用限制與修飾的輔助因子ATPMg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸）Mg2+ATPMg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸）識別序列特異性，非對稱序列特異性，旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性，非對稱序列切割位點(diǎn)特異性位點(diǎn)5’端至少1000bp在識別序列內(nèi)部或附近距特異性位點(diǎn)3’端24-26bp處切割方式隨機(jī)切割特異切割特異切割第9頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月1、

Ⅱ類RE（1）.命名主要內(nèi)容是:①基本名稱有機(jī)體屬名的第一個字母(大寫)和種名的前兩個字母(小寫),組成酶的②菌株第一個字母加在基本名稱之后;大寫字母表示酶的編碼基因?yàn)槿旧w外遺傳成分。③發(fā)現(xiàn)次序羅馬數(shù)字表示④系統(tǒng)名稱RE為R,甲基化酶為M,通常省略第10頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月例如R-HindIII表示限制性核酸內(nèi)切酶,相應(yīng)的甲基化酶用M-HindIII表示。但在實(shí)際應(yīng)用中,尤其是在上下文已交代得很清楚時,限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)名稱R常被省略。第11頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月HindIIIH=genusHaemophilus

in=speciesinfluenzae

d=strainRd III=thirdendonuclease isolated第12頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月2.識別序列A一般識別序列為4-8bp，大部分為雙重旋轉(zhuǎn)對稱的回紋結(jié)構(gòu)，即一條5’-3’與另一條為3’-5’的堿基相同第13頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

B在某些5或6bp的識別序列中，存在內(nèi)部簡并或外部簡并。

EcoRⅡ可切割CAGGCCGG內(nèi)部簡并

CTGGXhoⅡ可切割RGATCY外部簡并

Y：T或CR：A或G簡并不影響內(nèi)切酶和甲基化酶的活性，增加了目標(biāo)序列的頻率第14頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月C

同裂酶isoschizomers)

指來自不同有機(jī)體，識別切割相同序列的一組酶第15頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

切割位置相同HindIII和HsaI均

AAGCTT

切割位置不同XmaICCCGGGSmaICCCGGG甲基化影響同裂酶是否切割

MspIHpaⅡ?yàn)橥衙府?dāng)識別序列CC＊GG的第二個C甲基化后HpaⅡ就不能切割了第16頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月D同尾酶同尾酶（isocaudamer）來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端。第17頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠG↓GATC,BclⅠT↓GATC，BglⅡA↓GATC,Sau3AⅠ↓GATCXhoⅡR↓GATC就是一組同尾酶由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段可通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用而連接。在基因克隆中很有用。第18頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的切割方式及意義（1）三種切割方式

A從識別序列中間切開產(chǎn)生平末端（bluntend)

第20頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

B從5’-3’鏈上對稱軸左方切開和3’-5’鏈上對稱軸右方切開形成具有凸出的5’磷酸基團(tuán)的粘性末端第21頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月C從5’-3’鏈上對稱軸右方切開和3’-5’鏈上對稱軸左方切開形成具有凸出的3’羥基基團(tuán)的粘性末端第22頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月有些限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列為間斷型回文結(jié)構(gòu),酶的切點(diǎn)定位于核昔酸N中,BglI(GCCNNNN↓NGGC)、NdeI(C↓TNAG)、SfiI(GGCCNNNNN↓NGGCC)XmnI(GAANN↓NNTTC)等。第23頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月有極少數(shù)Ⅱ

型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識別序列,如MboⅡ

識別GAAGA序列,切割位點(diǎn)則是:5'-GAAGANNNNNNNN↓N-3'3'-CTTCTcmNNNNNN↓N-5'這種切割位點(diǎn)大都出現(xiàn)于非回文型序列的酶之中。第24頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一些RE及其切割序列第26頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端意義：

A用相同內(nèi)切酶切割后的片段能在5’端靠堿基配對將單鏈重疊成雙鏈。促使不同的DNA分子相連，或使一個DNA片段首尾相連而自身環(huán)化。B處理DNA片段時，不同酶消化產(chǎn)生的DNA末端往往起到不同的作用凸出的5’磷酸基團(tuán)易進(jìn)行同位素標(biāo)記，凸出的3’羥基易進(jìn)行同聚物加尾第27頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月粘端補(bǔ)為平端

GAATTCGGAATTCTTAAGCTTAACTTAA粘端變?yōu)槠蕉?/p>

CTGCAGGGGACGTCACGTCCEcoRI

DNA多聚酶PstIT4DNA聚合酶第28頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.Ⅱ型RE的反應(yīng)條件(1)標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立一個單位的限制性核酸內(nèi)切酶定義為:在合適的溫度和緩沖液中,在20μL反應(yīng)體系中,1h完全降解1μgDNA所需要的酶量。第29頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酶解過程1.酶解體系2.混勻3.反應(yīng)終止4.酶解結(jié)果鑒定第30頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酶解過程

酶切反應(yīng)體系

質(zhì)粒DNA1.5μl10×MCbuffer2.0μlBamHⅠ0.2μlBSA0.1μlddH2Otototal20.0μl第31頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月RE酶切反應(yīng)的終止65℃5min使大多數(shù)RE鈍化。對不易印鈍化的需特殊方法，如加SDS或尿素，但兩者不易從DNA中去除。需抽提才可以。（方法同DNA提取的抽提）第32頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月5.影響RE活性的因素（1）DNA純度

DNA制劑中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高鹽濃度等，影響RE的活性。提高酶切效率方法：1.增加RE用量≥100U/μl2.擴(kuò)大反應(yīng)體積以使?jié)撛诘囊种埔蛩叵鄳?yīng)稀釋3.延長酶切時間第33頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）DNA甲基化程度

甲基化作用會強(qiáng)烈影響酶活性。基因工程中用的菌株為喪失了甲基化酶的。不同位點(diǎn)之間的甲基化程度是不相同的且與DNA來源的細(xì)胞類型有密切關(guān)系。

用處：

1.改變RE的識別序列的特異性。

2.酶切前保護(hù)內(nèi)部識別位點(diǎn)第34頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）酶切反應(yīng)溫度

不同RE具有不同的最適反應(yīng)溫度一般為37℃

也有例外如SmaI25℃ApaI30℃

高于可低于最適反應(yīng)溫度會導(dǎo)致酶失活第35頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）DNA分子結(jié)構(gòu)超螺旋比線性DNA需酶量大，最高可達(dá)20倍另外切割于不同DNA部位的限制位點(diǎn)時，效率也不同，但最多不會相差10倍第36頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）RE的緩沖液緩沖液組分包括：①M(fèi)g2+；②Tris-Hcl使pH處于最佳數(shù)值范圍內(nèi)③保護(hù)酶穩(wěn)定性的物質(zhì)

β-巰基乙醇、（DDT)、（BSA)第37頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月星號活性：非特適條件（酶濃度高，甘油高、代離子強(qiáng)度，高pH）等常使酶發(fā)生不正確切割，切割特異性。第38頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月5.RE對DNA的消化作用第39頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）限制性內(nèi)切酶對DNA的局部消化

理論上：一條DNA分子上4種核苷酸量相等。

NNNN GATC

?x?x?x?=1/256

則6Base(?)6=1/40968base(?)8=1/65,536

第40頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月則RE的識別頻率為：1/4N

N為核苷酸的識別序列的堿基數(shù)即每隔4N個堿基就切割一次DNA第41頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月完全酶切消化（completedisestion)

如果一種RE對DNA分子的切割達(dá)到了這樣的片段（4N）的水平稱之為完全酶切消化第42頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月局部酶切消化（partialdigestion)

RE對大量的DNA的消化不進(jìn)行完全，可獲得分子量大小有所增加的限制片段產(chǎn)物，稱這為局部酶切消化第43頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）RE對真核DNA的消化作用

真核生物基因組大，可達(dá)109左右，RE切后有105_106種不同大小的DNA片段用普通方法（電泳或液相色譜）無法分析，建基因文庫才行。第44頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

在某質(zhì)粒上有四個HindⅢ的酶切位點(diǎn)用，即用HindⅢ酶應(yīng)得到3.6、5.3、7.4、和11.4KB的四個片段。但是用HindⅢ切割從被感染的寄主細(xì)胞中分離到的該質(zhì)粒DNA時，只得到3個片段，分別是7.4、8.9和11.4KB，根據(jù)你掌握的知識分析可能的原因。第45頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

一個線性DNA分子用兩種限制性內(nèi)切酶酶切，結(jié)果如下：

BamHⅠ8.0，7.5，4.5，2.9kbBglⅡ13，6，3.9kbBamHⅠ+BglⅡ7.5，6，3.5，2.9，2,1kb

請畫出這個線性DNA的限制酶圖譜。623.57.512.9BglⅡBamHⅠBamHⅠBamHⅠBglⅡ第46頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

連接酶是一種能夠催化DNA上裂口兩側(cè)（相鄰）核苷酸裸露的3’羥基和5’磷酸之間形成共價結(jié)合的磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA裂口重新連接起來的酶。二、連接酶第47頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

連接過程1.輔助因子裂開后形成酶-腺苷酸（AMP）復(fù)合物，2.然后復(fù)合物接合到切口上，形成磷酸二酯鍵，產(chǎn)釋放AMP，3.酶-AMP復(fù)合物同具有3’-OH和5’P基團(tuán)的切口接合，4.AMP同磷酸基團(tuán)反應(yīng)，并使其同3’OH基團(tuán)接觸，產(chǎn)生新的磷酸二酯鍵，從而使切口封閉。第49頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月ATPppiT4DNA連接酶NAD+NMNE.coliDNA連接酶酶-AMP酶OHPOHAPPAMPDNA連接酶的分子機(jī)理5’3’5’3’3’5’NAD+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NMN煙酰胺單核苷酸ATP腺苷三磷酸AMP腺苷一磷酸第50頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月可連接切口(nick）或斷口(cut)，但不能連接缺口(gap)可連接雙鏈DNA分子的一部分，但不能連接單鏈DNA分子第51頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第52頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月二、DNA連接酶的種類大腸桿菌DNA連接酶T4噬菌體DNA連接酶第53頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.T4噬菌體DNA連接酶

T4噬菌體DNA連接酶(又稱T4DNA連接酶)分子質(zhì)量為68Ku,需要ATP作為輔助因子,最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的。第54頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月T4噬菌體DNA連接酶可以連接:

①兩個帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA分子;②兩個帶有平頭末端的雙鏈DNA分子;③一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子④RNA:DNA雜合體中RNA鏈上的切口,也可將RNA末端與DNA鏈連接。第55頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月T4DNA連接酶Mg2+ATP第56頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月2.大腸桿菌DNA連接酶

大腸桿菌DNA連接酶分子質(zhì)量為75Ku,需要NAD+作輔助因子。第57頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌DNA連接酶可連接：①兩個帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA分子;②一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子。由于對DNA末端要求比較嚴(yán)格