細胞滲透性實驗步驟

....細胞滲透性試驗試驗材料：Caco-2細胞；DMEM(Gln，無丙酮酸，Gibco/Invitrogen,cat.no.41965-039)；DMEM+10%FCS+1%NEAA(Gibco/Invitrogen,cat.no.11140-035)；DMEM-DMEM+10%FCS+1%NEAA+1%雙抗〔Gibco/Invitrogen,cat.no.15140-1223. 0.25%胰酶+EDTA；3NaHCO0.35g/L〕,PH=7.4并過濾除菌〔假設(shè)要模擬小腸酸環(huán)境或爭論5的甲磺酸代替3DMSOHBSS時使用，99.5%純度，作為共溶劑，使用時DMSO終濃度不1%[14C]mannitol〔suppliedbyNENLifeScienceProducts，具有放射性〕或用fluorescentcompoundluciferyellow〔需要的藥物濃度高于[14C]mannitol〕HPLC溶劑；BSABSA；HBSSPH值，PH7.46.5。要點：Caco-2[14C]mannitol作markerCaco-21.2±0.5×10-7cms-1，假設(shè)通透系數(shù)大于5×10-7cms-1，則認為單細胞層受到了藥物的影響，假設(shè)通透系數(shù)大于1×10-6cms-1，則認為單細胞層遭到破壞；對于主動轉(zhuǎn)運，首先使用低濃度藥物如10μM或更低的濃度進展試驗以避開轉(zhuǎn)運蛋白的飽和轉(zhuǎn)運；對于被動運輸mM數(shù)量級的濃度進展試驗，這樣，主動運輸飽和，此時的運輸主要是被動運輸。試驗器材：73ml;r37TER〕檢測儀，帶有Millicell-ERS-voltmeter〔Millipore〕或EvohmepithelialvoltmeterEndohm組織電阻測量室〔WPICorningCostarTranswellpermeablesupports(12-wellplates,cat.no.3401)，12-wellcellcultureclusterswithlids(CorningCostar,cat.no.3512)，器〔scintillationcounter,UV-platereader,fluorescenceplatereaderorHPLC(-MS)〕細胞預(yù)備2Caco-2細胞培育，培育基：DMEM+10%FBS+1%NEAA+5mMGln，培育條件：37℃，5%CO40代以上，對于2代后使用〕2檢測細胞活性轉(zhuǎn)移細胞至試管中，用沉降法去除細胞團和細胞碎片；轉(zhuǎn)移含細胞的上清液至試管中，PI染色，計數(shù)細胞量，死細胞量<5%；離心細胞400g，5min，去除上清；DMEM-0.6×106cellsml-112filters120.1mlfilters2min，滴加0.5mlfilter3×105cellsml-1；1.5mlDMEM-雙抗培育基；376-16h16h棄去頂側(cè)培育基，補加0.5mlDMEM-雙抗培育基，目的是去除未貼壁細胞，預(yù)防多細胞層的形成；每兩天，棄去基底側(cè)培育，認真并緩慢的棄去頂側(cè)培育基，向頂側(cè)補加0.5ml穎培育1.5ml穎培育液〔留意避開槍頭接觸到細胞層重復(fù)上述換液步驟，持續(xù)培育細胞至21-2921天時，細胞已經(jīng)表達多種轉(zhuǎn)運接種的單層細胞狀態(tài)檢測：使用鬼筆環(huán)肽檢測或使用細胞核染色觀看；試驗步驟12-24h2h預(yù)備藥物溶液，預(yù)熱全部溶液至37℃，在工作臺上放置保溫板；121.5mlHBSS，輕輕倒出單細胞層上的培育液，并轉(zhuǎn)移至含HBSS0.5mlHBSS37℃，15-20min〔100.37EndohmtissueresistancemeasurementchamberTER值〔依據(jù)操作手冊TER值與溫度有關(guān)，溫度低，TERTER，37℃TER<165Ωcm2的孔不能用于試驗0.4mlC01.2ml從頂側(cè)向基底側(cè)的檢測(absorptive，Apical-to-basolateral，ab)HBSSfilterinsertsHBSSfilterinserts至預(yù)備的孔板內(nèi)；filterinserts內(nèi)參與藥物溶液〔t=0C0〕從基底側(cè)向頂側(cè)的檢測(secretory，Basolateral-to-apical，ba)預(yù)備的孔板，基底側(cè)參與藥物溶液，取出filterinserts，輕輕倒出上面的HBSS；HBSS〔t=0〕并馬上從基底側(cè)吸取藥物溶液樣本〔C037℃，500.的搖床上培育孔板；設(shè)置4-5個取樣時間點〔對于轉(zhuǎn)運快的親脂性藥物可設(shè)置5min，轉(zhuǎn)運慢的親水性藥物可設(shè)置1hab試驗，從基底側(cè)取樣，對ba試驗，從頂側(cè)取樣，補加穎的HBSS；試驗完畢時，吸取原始藥物加樣孔內(nèi)的樣品，用于計算物質(zhì)平衡；TER值〔樣品假設(shè)穩(wěn)定性好，可一起定量分析步驟scintillationcounting計算放射性標記的藥物，HPLCUV，熒光或MS則可能是因該藥物是高度親脂性化合物，此時可在基底側(cè)參與終濃度4%的BSA，但最終計算的滲透系數(shù)要比正常高，因此檢測時最好想方法去除參與的BSA計算公式滲透系數(shù)〔P ，單位：cms-1〕appPapp

=〔dQ/dt〕(1/(AC))0dQ/dtdpms-1μmols-1；Afiltercm2；C00dpmliter-1μM。液體的補償效應(yīng)有如下公式計算：此種計算方法的前提條件是取樣的藥物濃度不超過藥物起始濃度的10%，當(dāng)不考慮這個前提條件時，用如下公式：RD R V是藥物溶液的體積，V是另一側(cè)的體積，A是filter面積，M是藥物的總數(shù)，C 是在接收組中第一個時間點的藥物濃度，C〔t〕是在時間點tRD R 其他計算公式質(zhì)量平衡計算公式D C起始藥物濃度，C0表示試驗開頭時的數(shù)值，fin表示試驗D C 完畢時的數(shù)值， 表示在每個取樣時間點藥物的濃度，C S(t)app量平衡>80%時，可承受P 值。appapp,ba 流出率〔effluxratio〕=P /P app,ba 比照組設(shè)置Endohmtissueresistancemeasurementchamber37TER，使用[14C]mannitolTER。37HBSS〔PH7.4mannitol2.5–5×105dpmml-137℃孵育；預(yù)備閃耀瓶〔scintillationvials3-4filterinsertsinserts12-wellcluster內(nèi)，HBSS151.5ml0.5mlTER值；123-41.2mlHBSS；insertsHBSSinserts放入上一步預(yù)備的孔內(nèi)；inserts0.45mlmannitol0.05mlC0〕參與閃耀瓶內(nèi)；37℃的搖床上培育；300.6ml液體，并向孔板中補加預(yù)熱的0.6mlHBSS；連續(xù)在搖床上培育30min，重