PCR原理-教學(xué)講解課件

第二章

基因操作的主要技術(shù)原理

醫(yī)學(xué)課件1第二章醫(yī)學(xué)課件1核酸的凝膠電泳擴增原理分子雜交測序醫(yī)學(xué)課件2核酸的凝膠電泳醫(yī)學(xué)課件2核酸的凝膠電泳

它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。醫(yī)學(xué)課件3核酸的凝膠電泳醫(yī)學(xué)課件3基本原理

帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。

醫(yī)學(xué)課件4基本原理醫(yī)學(xué)課件4電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子遷移率要快

醫(yī)學(xué)課件5電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DN凝膠電泳的分辨力：與凝膠的類型和密度相關(guān)瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間;

聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之間醫(yī)學(xué)課件6凝膠電泳的分辨力：醫(yī)學(xué)課件6瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為常熔點的瓊脂糖和低熔點（LMP）瓊脂糖。醫(yī)學(xué)課件7瓊脂糖凝膠電泳醫(yī)學(xué)課件7LMP瓊脂糖熔點：62～65℃

熔解后，在37℃

可保持液態(tài)數(shù)小時；在25℃

可保持液態(tài)約10min

醫(yī)學(xué)課件8LMP瓊脂糖醫(yī)學(xué)課件8回收DNA分子在65℃

下將LMP瓊脂糖凝膠熔化；加入過量的酚抽提DNA；離心獲得含DNA分子的上清液；直接酶切

醫(yī)學(xué)課件9回收DNA分子醫(yī)學(xué)課件9瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：

緩沖液：1×TAE（TBETPE）凝膠的含量：根據(jù)檢測的DNA大小加DNA樣品：<1μg，指示劑電泳條件：大片斷低電壓長時間，小片段高電壓短時間染色和觀察：溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波長的紫外下觀察（凝膠成像儀）。能看到0.05μg的微量DNADNA的片斷大小與熒光強度成正比

醫(yī)學(xué)課件10瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：醫(yī)學(xué)課件10SeparationRangeVs.%AgaroseLowGelingAgarose4-6 0.02-0.4醫(yī)學(xué)課件11SeparationRangeVs.%Agarose醫(yī)學(xué)課件12醫(yī)學(xué)課件12

用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對DNA片斷大小的估算

醫(yī)學(xué)課件13用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對DNA片斷大小的估算醫(yī)學(xué)課件13SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA醫(yī)學(xué)課件14SampleWell124681012kbAgarose根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小醫(yī)學(xué)課件15根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小醫(yī)學(xué)課Agarosegelelectrophoresis醫(yī)學(xué)課件16Agarosegelelectrophoresis醫(yī)學(xué)課Agarosegelelectrophoresis醫(yī)學(xué)課件17Agarosegelelectrophoresis醫(yī)學(xué)課聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液：TBE凝膠聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亞甲雙丙稀酰胺（29：1）；TEMED和過硫酸銨（10％）。醫(yī)學(xué)課件18聚丙烯酰胺凝膠電泳醫(yī)學(xué)課件18PolyAcrylamideGels醫(yī)學(xué)課件19PolyAcrylamideGels醫(yī)學(xué)課件19脈沖電場凝膠電泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor發(fā)明的。分離超大分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成45℃角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成45℃角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時調(diào)整其泳動的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率就慢，從而達到了分離大分子量DNA分子的目的。醫(yī)學(xué)課件20脈沖電場凝膠電泳（PFGE）醫(yī)學(xué)課件20在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成45℃角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成45℃角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時調(diào)整其泳動的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率就慢，從而達到了分離大分子量DNA分子的目的。107bp的DNA大分子。醫(yī)學(xué)課件21在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸PFGEcanresolvelargeDNAfragments醫(yī)學(xué)課件22PFGEcanresolvelargeDNAfra基因擴增（geneamplification）

主要內(nèi)容：

1.體外擴增

2.通過體外重組和轉(zhuǎn)化，將目的基因在宿主細胞進行擴增

3.在環(huán)境作用下，生物體內(nèi)相關(guān)基因的擴增。

4.程序基因擴增

5.進化過程中的基因擴增醫(yī)學(xué)課件23基因擴增（geneamplification）醫(yī)學(xué)課件23PCR技術(shù)在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的。

PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。醫(yī)學(xué)課件24PCR技術(shù)醫(yī)學(xué)課件24(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)醫(yī)學(xué)課件25(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。醫(yī)學(xué)課件26溫度（℃）時間（min）9494℃變性（1min）60℃退ReactionConditionforaTypicalPCRAssay醫(yī)學(xué)課件27ReactionConditionforaTypicTypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength醫(yī)學(xué)課件28TypicalPCRThermalProfile*ThSomeDNAPolymerasesUsedinPCR醫(yī)學(xué)課件29SomeDNAPolymerasesUsedinPCharacteristicsofTaqPolymerase

醫(yī)學(xué)課件30CharacteristicsofTaqPolymPCR引物：與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。

1.其長度通常在15~30個核苷酸之間。

2.簡并引物atggctant…3.嵌套引物

PCR擴增的長度：<2kb醫(yī)學(xué)課件31PCR引物：醫(yī)學(xué)課件31PCR技術(shù)的應(yīng)用：

1.基因組克隆突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核算序列。醫(yī)學(xué)課件32PCR技術(shù)的應(yīng)用：醫(yī)學(xué)課件32醫(yī)學(xué)課件33醫(yī)學(xué)課件33反相PCR(reversePCR)與染色體步移醫(yī)學(xué)課件34反相PCR(reversePCR)與染色體步移醫(yī)學(xué)課件34不對稱PCR(asymmertricPCR)

用來制備單鏈的DNA

特點：兩種引物的濃度不同，低濃度的限制引物和高濃度引物，兩者濃度相差約100倍。獲得單鏈核苷酸的另一種方法是通過固相支持物作DAN鏈的特意洗脫。（生物素—鏈霉素包裹的磁珠）醫(yī)學(xué)課件35不對稱PCR(asymmertricPCR)醫(yī)學(xué)課件35RT－PCR:

在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進行的PCR

檢測RNA分子；獲取測序模板DNA；克隆mRNA之cDNA拷貝。醫(yī)學(xué)課件36RT－PCR:醫(yī)學(xué)課件36基因的體外誘變醫(yī)學(xué)課件37基因的體外誘變醫(yī)學(xué)課件37基因組的比較研究：

10個堿基作引物用隨機引物擴增出的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳后所呈現(xiàn)的帶型，反映著用作模板的DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征。醫(yī)學(xué)課件38基因組的比較研究：醫(yī)學(xué)課件38核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

醫(yī)學(xué)課件39核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)醫(yī)學(xué)

雜種核酸分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。

DNA/DNA的雜交作用檢測特定生物有機體之間的親源關(guān)系

DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。醫(yī)學(xué)課件40雜種核酸分子：醫(yī)學(xué)課件40核酸雜交常用幾種膜的性能比較醫(yī)學(xué)課件41核酸雜交常用幾種膜的性能比較醫(yī)學(xué)課件41硝酸纖維素膜不能滯留小于150bp的DNA片斷，不能同RNA結(jié)合。

應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片斷DNA的滯留能力。

RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。醫(yī)學(xué)課件42硝酸纖維素膜醫(yī)學(xué)課件42

尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：

1.核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進行雜交。醫(yī)學(xué)課件43尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：醫(yī)學(xué)課件431、薩瑟恩DNA印跡雜交根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。醫(yī)學(xué)課件441、薩瑟恩DNA印跡雜交醫(yī)學(xué)課件44

印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理：分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時間不同；浸泡在0.25M的HCL溶液中脫嘌呤，再進行堿變性堿水解，DNA鏈斷裂單鏈醫(yī)學(xué)課件45印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理：醫(yī)學(xué)課件45（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)醫(yī)學(xué)課件46（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。醫(yī)學(xué)課件47SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片醫(yī)學(xué)課件47

在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時，

1.要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時；

2.紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯(lián)。

醫(yī)學(xué)課件48在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時，醫(yī)學(xué)課件482、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。醫(yī)學(xué)課件492、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting3、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交

斑點印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設(shè)計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。醫(yī)學(xué)課件503、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交醫(yī)學(xué)課件50

通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。醫(yī)學(xué)課件51通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品4、菌落雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。鑒定重組子。醫(yī)學(xué)課件524、菌落雜交醫(yī)學(xué)課件52檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)醫(yī)學(xué)課件53檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)醫(yī)學(xué)課件53蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù)醫(yī)學(xué)課件54蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù)醫(yī)學(xué)課件54凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）

又叫DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。原理：

DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時遷移率的降低。醫(yī)學(xué)課件55凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）醫(yī)凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于同一種細胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合醫(yī)學(xué)課件56凝膠阻滯實驗的基本原理圖ACB放射自顯影****凝膠電泳放射不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子而且可以研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標(biāo)記競爭DNA）醫(yī)學(xué)課件57不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定(a)(b)

(c)

在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。**********蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競爭DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影蛋白質(zhì)與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合**********醫(yī)學(xué)課件58(a)(b)(c)在凝膠阻滯實驗中競爭DNA

可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1.用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子

2.在競爭DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。醫(yī)學(xué)課件59可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。醫(yī)

凝膠阻滯實驗?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息，但無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。而DNaseⅠ足跡實驗可以解決這個問題醫(yī)學(xué)課件60凝膠阻滯實驗?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用DNaseⅠ足跡實驗（footprintingassay）

是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術(shù)。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。醫(yī)學(xué)課件61DNaseⅠ足跡實驗（footprintingassay）32p1510*14810*加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510AB足跡(a)(c)(b)DNaseI足跡實驗醫(yī)學(xué)課件6232p1如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。醫(yī)學(xué)課件63如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中硫酸二甲酯（DMS）足跡實驗：

DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶會對甲基化的G殘基作特異的化學(xué)切割。而與蛋白結(jié)合的DNA片斷上的G殘基，不會被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片斷的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片斷，出現(xiàn)了空白區(qū)。醫(yī)學(xué)課件64硫酸二甲酯（DMS）足跡實驗：醫(yī)學(xué)課件64甲基化干擾實驗（methyltioninterferenceassay）根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會有什么效應(yīng)，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。

醫(yī)學(xué)課件65甲基化干擾實驗（methyltioninterferencGGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化與蛋白質(zhì)提取物混合與蛋白質(zhì)結(jié)合不與蛋白質(zhì)結(jié)合與蛋白質(zhì)結(jié)合凝膠電泳與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA帶含有Ⅰ和Ⅲ兩種類型DNA片段不能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA帶含有全部三種類型DNA片段切除所有結(jié)合與不結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA帶，并用六氫吡啶切割甲基化的G殘基結(jié)合帶非結(jié)合帶缺失的DNA帶表明相應(yīng)G殘基的重要意義，它得到結(jié)合蛋白質(zhì)的保護甲基化干擾實驗醫(yī)學(xué)課件66GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGG4、體內(nèi)足跡實驗GG×GG×meGGGGMeMe完整的細胞裸露的DNADMS硫酸二甲酯分離DNA并用六氫吡啶切割凝膠分析PCR擴增受保護的G殘基應(yīng)用甲基化保護作用進行的體內(nèi)足跡實驗醫(yī)學(xué)課件674、體內(nèi)足跡實驗GG×GG×meGDNA核苷酸序列分析醫(yī)學(xué)課件68DNA核苷酸序列分析醫(yī)學(xué)課件68傳統(tǒng)的DNA序列分析法：

Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)分析法新發(fā)展的DNA雜交測序法醫(yī)學(xué)課件69傳統(tǒng)的DNA序列分析法：醫(yī)學(xué)課件69Sanger雙脫氧鏈終止法原理：雙脫氧鏈終止法要求使用一種單鏈的DNA模板和一種適當(dāng)?shù)腄NA合成引物。利用DNA聚合酶的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長。醫(yī)學(xué)課件70Sanger雙脫氧鏈終止法原理：醫(yī)學(xué)課件70醫(yī)學(xué)課件71醫(yī)學(xué)課件71醫(yī)學(xué)課件72醫(yī)學(xué)課件72醫(yī)學(xué)課件73醫(yī)學(xué)課件73影響因素：

dNTP/ddNTP=1:100，DNA的譜帶分離效果較佳?？勺x出200個以上的核苷酸順序。降低ddNTP與dNTP的比例，就會產(chǎn)生出逐漸加長的片段產(chǎn)物，用聚丙烯酰胺凝膠分離，可讀出300個左右的核苷酸順序。醫(yī)學(xué)課件74影響因素：醫(yī)學(xué)課件74

必須用限制性內(nèi)切酶把高分子量的DNA分子消化為合適的片斷，經(jīng)電泳分離純化后，才能用來序列分析。采用分子克隆的方法，即將酶切消化的片斷隨機的連接到一種適合的載體上。引物（通用引物）是載體上的一段序列，它能特異性的同載體分子上克隆位點相連的單鏈DNA區(qū)段雜交。醫(yī)學(xué)課件75必須用限制性內(nèi)切酶把高分子量的DNA分Sanger雙脫氧-M13體系

M13是噬菌體載體，可以得到單鏈的DNA序列。Sanger雙脫氧-pUC體系pUC是一種質(zhì)粒載體，利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。

醫(yī)學(xué)課件76Sanger雙脫氧-M13體系醫(yī)學(xué)課件76醫(yī)學(xué)課件77醫(yī)學(xué)課件77醫(yī)學(xué)課件78醫(yī)學(xué)課件78醫(yī)學(xué)課件79醫(yī)學(xué)課件79醫(yī)學(xué)課件80醫(yī)學(xué)課件80Maxam-Gilbert化學(xué)分析法1977年由美國大學(xué)A.M.Maxam和W.Gilbertf發(fā)明。原理：用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片斷，造成堿基的特異性切割。由此產(chǎn)生的一組具有不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影之后，便可根據(jù)x光底片上所顯示的相應(yīng)譜帶，直接讀出待測DNA片斷的核苷酸序列。醫(yī)學(xué)課件81Maxam-Gilbert化學(xué)分析法醫(yī)學(xué)課件81

由于這種化學(xué)切割反應(yīng)的特異性是由堿基的修飾作用決定的，所以切割反應(yīng)必定是定量的?；瘜W(xué)切割反應(yīng)的試劑：肼（hydrazine）硫酸二甲酯（dimethylsulphate）醫(yī)學(xué)課件82由于這種化學(xué)切割反應(yīng)的特異性是由堿基的

肼：又叫聯(lián)氨（NH2.NH2），在堿性條件下，與胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用。再通過六氫吡啶的作用，使兩個磷酸分子從糖片斷上釋放出來，從而導(dǎo)致在核苷酸位置上發(fā)生DNA的斷裂。醫(yī)學(xué)課件83肼：醫(yī)學(xué)課件83

鹽存在的條件下，聯(lián)氨同胸腺嘧啶（T）的反應(yīng)便會被抑制，最終只發(fā)生胞嘧啶堿基特異的切割反應(yīng)。由此來區(qū)別C和C+T這兩種化學(xué)反應(yīng)。醫(yī)學(xué)課件84鹽存在的條件下，聯(lián)氨同胸腺嘧啶（T

硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）一種堿性的化學(xué)試劑。在它的作用下，DNA堿基環(huán)中的氮原子會發(fā)生甲基化反應(yīng)，在中性的PH值環(huán)境中，可導(dǎo)致配糖鍵發(fā)生水解，使去堿基的糖-磷酸鍵十分微弱，在堿性條件下磷酸分子就能從DNA鏈上脫落，造成鏈的斷裂。鳥嘌呤（G）的N7>腺嘌呤(A)的N34～10倍

醫(yī)學(xué)課件85硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）醫(yī)學(xué)課件85

在六氫吡啶的作用下，從脫氧核糖上移去2個磷酸分子，使DNA鏈在甲基化的鳥嘌呤G位點斷裂。醫(yī)學(xué)課件86