pcr的發(fā)展歷程課件

PCR的發(fā)展歷程PCR的發(fā)展歷程1PCR技術(shù)的基本原理

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1983年由美國(guó)科學(xué)家KaryMullis提出，1993年因此而獲諾貝爾獎(jiǎng)。PCR技術(shù)是指通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。PCR技術(shù)的基本原理

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

192①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定3標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：4PCR的發(fā)展史

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。PCR的發(fā)展史5第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增

用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個(gè)裝有PCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。

這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，與自動(dòng)化基因擴(kuò)增儀相比，它無須升降溫過程，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，試驗(yàn)更接近理想PCR反應(yīng)條件。第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增6第二代：自動(dòng)化控制型PCR特點(diǎn)：使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)大等不足。第二代：自動(dòng)化控制型PCR特點(diǎn)：使用廣泛及具有代表性，采用瓊7第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷，并對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，1992年誕生了所謂“第三代PCR"的熒光定量實(shí)時(shí)PCR。

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒、光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定、量分析的方法?！?/p>

第三代PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷8數(shù)字PCR

由于定量PCR的分析最終結(jié)果依賴于Cq值，在這個(gè)意義上所謂的“定量”也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字PCR"應(yīng)運(yùn)而生。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。因此特別適用于依靠