單胞藻培養(yǎng)管理(生物餌料培養(yǎng)課件)

二級培養(yǎng)室01生產(chǎn)中常用的培養(yǎng)容器02透明尼龍袋03白色塑料桶光反應(yīng)器透明尼龍袋一般用透明農(nóng)用薄膜制成，大小不等，袋口用1根直徑為3~5cm，長10~15cm的硬性塑料管固定，充氣管和氣頭從中經(jīng)過。尼龍袋最好一次性使用。二級培養(yǎng)室白色塑料桶容量大小以50L為宜，桶的上方用電烙鐵鉆1個小孔，孔徑大小以充氣管通過即可。桶口蓋一層消毒過的透明尼龍薄膜，再用圓松緊帶扎口，便于透光。一般育苗廠最好配備200~500只，可以消毒后反復(fù)使用。二級培養(yǎng)室光反應(yīng)器容量大小20~50L，可半連續(xù)培養(yǎng)。二級培養(yǎng)室

三級培養(yǎng)室在生產(chǎn)中配有培養(yǎng)池、砂濾裝置、消毒池等。（1）培養(yǎng)池。培養(yǎng)池一般20~40只，以面積15~25m2、池深0.8~1m為宜?？刹捎没炷连F(xiàn)澆池，也可采用預(yù)制塊砌、磚砌，混凝土外涂。

三級培養(yǎng)室（2）砂濾池與砂濾罐。自海區(qū)抽人的海水，首先在沉淀池沉淀24h后，經(jīng)砂濾或過濾裝置以除去水中主要的生物或非生物的顆粒性雜質(zhì)，再經(jīng)過陶瓷過濾罐，除去做小的生物、通常采用二級砂濾池進(jìn)行水的過濾。

三級培養(yǎng)室（3）消毒池。微藻生產(chǎn)性培養(yǎng)的用水，常用漂白粉處理，殺死水中的微生物。這種化學(xué)藥物消毒海水的方法需要有2~3個專用海水消毒池，交替消毒和供水。

三級培養(yǎng)室采集水樣可取自天然水域，開敞的水面或小港灣皆可采集。采樣場所甄選可留意海岸上存留的小水洼。有一段時間和大海隔絕的小水洼，往往生長有適于靜水體培養(yǎng)的藻類，種類單純，容易分離。采樣場所甄選培養(yǎng)水生生物或貯水的容器、水池，也是采樣的理想場所。如要分離底棲微型硅藻，可刮取潮間帶的“油泥”，過濾即可獲得濃度很高的藻細(xì)胞水樣。采樣場所甄選此外，也可以把附著在大型藻類如海帶、馬尾藻等藻體，或其他物體上的附著藻類洗刷下來用作分離的水樣。采樣場所甄選（2）（3）（4）藻種收集藻種保存

（1）藻種選種

藻種處理

藻種分離生長迅速，無毒性，且易于收獲。A對極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大；B蛋白質(zhì)，脂類和糖類含量高，或有選擇地積累一種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）。C所選擇的生物種應(yīng)具有下列特征：一、選種1.選種的意義選擇出合乎人們生產(chǎn)需要的優(yōu)良品種。2.選育種的方法選擇育種在單細(xì)胞藻類生產(chǎn)的過程中，不經(jīng)過人為的處理而是利用其自然發(fā)生變異，有目的地、定向地把具有符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良性狀（生活力強(qiáng)、生長快、繁殖快、耐高溫等）的藻種留下進(jìn)培育。誘變育種通過誘變劑處理（亞硝酸、鈷60、快中子、氯化鋰、紫外線等），使藻細(xì)胞發(fā)生大量變異從中選出具有優(yōu)良性狀的變異個體。3.接種的方法液體接種將藻液直接加入培養(yǎng)液中進(jìn)行攪拌，加入的藻種分量視水溫而定，水溫較低（<10℃）時多加，約占培養(yǎng)液總量的30～40％左右；水溫適宜時（25～30℃），可加5～8％左右。干藻接種干藻的藻體接種，接種量為0.1～0.2％。二.藻種收集純種培養(yǎng)單種培養(yǎng)排除包括細(xì)菌在內(nèi)的一切生物的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細(xì)菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。二.藻種收集采集藻類要以各種藻類的生態(tài)環(huán)境、生活習(xí)性為基礎(chǔ)。藻類主要分布在水中，如湖、河、海洋，可分為固著、漂浮、浮游三類。在陸地潮濕處也有分布。從氣候條件看，一般在溫暖季節(jié)，藻類的種類和數(shù)量較多。有一些種類如藍(lán)藻在氣溫較高時生長特別繁盛；也有些種類如硅藻、甲藻在氣溫涼爽時較多。在不同環(huán)境條件中，藻類的組成成分是不同的,采取不同方法。03浮游藻類著生藻類

01漂浮藻類02對于生長在其他物體上較大型藻類，一般用手或鑷子采取。應(yīng)盡可能采取整個植物，包括它們的基部或著生部分。生長在土壤上的，最好用刀鏟取，盡可能少帶泥土（如專作土壤藻類研究，則應(yīng)分層采土，進(jìn)行培養(yǎng)）；生長在樹干上的，要用刀削取。生長在石上的，最好用小刀刮?。簧L在水生高等植物上的，要用鑷子取下生長藻類最多的部分葉、莖一同保存（盡可能記下植物名稱）；生長在土壤上的，最好用刀鏟取，盡可能少帶泥土（如專作土壤藻類研究，則應(yīng)分層采土，進(jìn)行培養(yǎng)）；生長在樹干上的，要用刀削取。1.著生藻類對于生長在其他物體上較大型藻類，一般用手或鑷子采取。應(yīng)盡可能采取整個植物，包括它們的基部或著生部分。生長在石上的，最好用小刀刮??；生長在水生高等植物上的，要用鑷子取下生長藻類最多的部分葉、莖一同保存（盡可能記下植物名稱）；生長在土壤上的，最好用刀鏟取，盡可能少帶泥土（如專作土壤藻類研究，則應(yīng)分層采土，進(jìn)行培養(yǎng)）；生長在樹干上的，要用刀削取。著生藻類著生藻類漂浮藻類在各種靜水水體中，常漂浮一些絲狀藻藻叢。采集時應(yīng)注意取同一藻叢上不同顏色部分或不同顏色的藻叢，特別是變成黃褐色部分常為生殖時期的植物體。如采集較長的、分枝的藻類，不宜折取一段藻體，而應(yīng)盡可能采整體。2.漂浮藻類3.浮游藻類浮游生物網(wǎng)一般用25號（網(wǎng)孔為0.06毫米）篩絹做成。在湖泊內(nèi)應(yīng)用的浮游生物網(wǎng)為圓錐形，口徑約20厘米，網(wǎng)長約60厘米準(zhǔn)備好采集工具，在水面較寬、較深水體中要用:采水瓶采取垂直分層定量藻樣和水樣需用采水瓶。

制作時，可用直徑約3～4毫米的銅條或粗鉛絲作一環(huán)，來支持網(wǎng)口，使它成環(huán)形。用金屬（如鋁、鋼精或銅）或玻璃小筒，套結(jié)在網(wǎng)底，通常稱為網(wǎng)頭，用來收集過濾到的藻類。由于濾液內(nèi)有浮游動物，如時間放得較久，往往藻類有不少被浮游動物吞食，所以若不馬上觀察，需用固定液固定。若用來分離藻種，可用13號篩絹（網(wǎng)孔0.1毫米）再將濾液過濾一次備用。有些地方購買篩絹較困難，也可不用浮游生物網(wǎng)，而用采水瓶，或一般器皿。但因藻類個體較少，最好多采些水樣，待沉積后觀察。（1）浮游生物網(wǎng)制作及使用取一個500mL（或1000mL）的廣口瓶，瓶底附一塊重1.5kg的鉛塊（或不銹鋼塊），用鉛絲固定在瓶底。瓶口橡皮塞穿三個孔，一孔插進(jìn)水的長玻管，一孔插排氣和出水的短玻管，一孔插溫度計。進(jìn)水管與出水管的上端都高出塞面3cm左右，進(jìn)水管下端接近瓶底，出水管下端接近塞底。用一根長約24cm的軟橡皮管，一頭緊套在排氣管上，不使脫落；另一頭則較松地套在進(jìn)水管上，并在此處扎一根細(xì)繩（既要扎牢，又不能影響以后排水）。還要在瓶頸上扎一根較粗的繩子，以沉下或拉起水瓶。（2）采水瓶制作采水瓶使用采樣時，將采水瓶沉沒到規(guī)定水層，向上拉細(xì)繩，使橡皮管與進(jìn)水管脫開，水即可迅速進(jìn)入采水瓶（為使進(jìn)水速度快些，玻管內(nèi)徑最好粗些，在10mm以上）。待3～5分鐘后，將瓶提出水面，先看水溫，再倒出水樣。硅藻衣藻藍(lán)藻大型海藻4.各種藻類的采集水綿衣藻分布很廣，絕大部分在淡水中。一般生活在有機(jī)質(zhì)豐富的較不流動的水溝、水池或臨時水洼中，在流動性的或清潔的水池里較少。南方農(nóng)民用的糞池或糞缸中（一般在糞不多而上層有較多水的缸），經(jīng)常有純粹的衣藻群，致使水呈綠色（有時還有眼蟲）。一般衣藻最多的時期是在春末、秋初，氣溫在10～20℃，在上海、江、浙一帶，一年四季幾乎都可采到。形成膠鞘體的常在漸趨干竭的水池岸邊。如欲得到較多且純粹的材料，可用大的廣口瓶盛入2/3有衣藻的池水帶回。瓶的一面用黑紙遮起，另一面承光，放在窗臺上。這樣，由于衣藻具有趨光性，大量聚集于光亮面，然后用吸管吸取備用。要得到結(jié)合生殖時期的衣藻，當(dāng)氣候驟然變化時就可能采到。如在上海，當(dāng)冬季寒潮到來的次日采集時，就會發(fā)現(xiàn)結(jié)合狀態(tài)的衣藻。（1）衣藻在池塘中，緩慢流動的河水中，有時在岸灘邊，可發(fā)現(xiàn)水綿，特別是春、秋兩季更多。生長初期它們是亮綠色，在衰亡和生殖時發(fā)黃。水綿用手觸之有滑潤的感覺（其他有些絲狀藻也會有滑潤感）。采集標(biāo)本時，應(yīng)該在一個水域中選擇若干不同地點，對不同顏色的都要采集，且不可看材料已變黃綠不潔，成一種破棉絮狀漂浮物時就棄之不采，因為這樣就常把生殖狀態(tài)標(biāo)本遺漏。在采集時，如要知道材料是否已經(jīng)是接合時期，除了觀察顏色是一種鑒別方法外，也可把盛有材料的容器正向著太陽光，用放大鏡在管外看一下。如果絲狀體上有褐色斑點則是形成了接合孢子，這樣的材料一定要帶回。（2）水綿硅藻在自然界中分布很廣，大量存在于水體中，在水底各種物體表面上都可以找到它們，經(jīng)常出現(xiàn)于潮濕巖石表面（呈黃棕色），在土壤里也常能見到。附生硅藻可用解剖刀從附著表面刮下來，采集土表硅藻可帶一層土。（3）硅藻大多存在于水體中，尤其當(dāng)大量發(fā)生成“水花”時（一般在高溫季節(jié)和水體富營養(yǎng)化后易產(chǎn)生）很易撈取觀察。另外，在水田、河灘、水溝邊土面如呈一片藍(lán)黑色也是藍(lán)藻，在雨后積水潭內(nèi)也能發(fā)現(xiàn)，可連泥一起采集。由于藍(lán)藻體表有粘膠層，常造成手觸有粘滑感。與其他藻類不同，藍(lán)藻能耐干旱，甚至在直射陽光下，干燥巖石上也可存在。（4）藍(lán)藻31Your

text對海藻生活習(xí)性的觀察和標(biāo)本的采集，一般是在潮間帶進(jìn)行的。潮間帶的采集簡單，不需特殊設(shè)備。潮間帶有巖礁、石縫、水峽、砂礫和其他各種各樣的環(huán)境，所以在這里可找到這個地區(qū)的絕大部分種類。Your

text潮間帶處于海洋與陸地相聯(lián)接的地帶，是指大潮期間潮水漲得最高的水面和退至最低線之間的地區(qū)。一般綠藻主要生長在潮間帶，褐藻、紅藻多數(shù)生長在潮間帶和潮下帶。（4）大型海藻大型海藻包括褐藻、紅藻和綠藻。采集地點的選定：32Your

text海藻一年四季均有生長，但因季節(jié)不同，各種藻類的生長和分布亦各有不同。一般說，南方在每年三、四月，而北方在五、六、七月為采集海藻最適宜時期（四、五月是海藻生長最盛、種類最多的時候，六、七月則能采到有繁殖器官的藻體）。Your

text海水每日兩次漲潮和退潮（有的地區(qū)例外），標(biāo)本采集工作，最好在退潮時，跟隨潮水退落時進(jìn)行。農(nóng)歷每月初一至初三及十五到十八是大潮期間，潮水退得最低，這時在巖岸及巖池中進(jìn)行采集標(biāo)本工作，能采到生活于潮間帶的各種海藻。（4）大型海藻采集地點的時間：分離藻種，首先要采集藻種水樣。采樣個體較大的浮游藻類，可用浮游生物網(wǎng)在水中撈取。通過浮游生物網(wǎng)的過濾，可獲得數(shù)量很大的藻類樣品。采樣但在水產(chǎn)動物的人工育苗中所需要的餌料藻類，一般是個體很小的幾微米到十幾微米的微型藻類，用浮游生物網(wǎng)無法有效采集。采樣因此，需要把含有微型藻類的水樣采回，在室內(nèi)通過超濾、離心等方法進(jìn)行處理。采樣2341

藻種分離意義：

為了要進(jìn)行某種藻類的科學(xué)研究或大量培養(yǎng)，有必要把某種藻類與其他生物分離。因為在培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中要受敵害生物的污染，只有分離出”純種”進(jìn)行培養(yǎng)，才能獲得好效果。藻種分離主要有以下四種。離心法趨向運動法稀釋法平板分離法將混合藻液放入離心管中離心，水中不同藻類和微生物都向離心管底部下沉，但下沉的速度不一樣，可將藻類分開。把不同時間下沉到管底的藻體取出鏡檢，選定含所需藻類較多的沉淀物，加培養(yǎng)液再離心，多次反復(fù)上述操作，可以獲得具有一定純度的所需藻種，但難以得到單一純度。1.離心法（1）優(yōu)點（2）缺點可消除細(xì)菌，并增加純粹分離的可能性，至少可作為藻種平板培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作。另外，在水液中藻體含量較少時，可用此法集中藻體。不能做到使不同藻類完全分離。

離心法某些藻類具有趨向性。在用光照射時，就會向光照處集中，這時即可把集中的藻體取出而移入另一容器中。對于有鞭毛的或具游動孢子的種類，如衣藻、鹽藻、扁藻等，都可利用此特性來分離藻種。將第一次獲得的藻體部分，移入已消毒的培養(yǎng)液中，再反復(fù)利用這種方法來分離，結(jié)果可得到有一定純度的藻體。這種分離效果較好，但只能用于運動型微藻。2.趨向運動法

把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。3.稀釋法

稀釋法用已消毒的試管5根，第一管中裝培養(yǎng)液9毫升，第2-5管中各裝9毫升，高壓蒸汽滅菌冷卻后，向第一管中加入1毫升混合藻液，充分震蕩，使均勻稀釋。用滅過菌的吸管自第一管中吸取）1毫升混合液移入第2管中，震蕩使均勻稀釋。同法依次移入第3-5管中，并都充分震蕩均勻稀釋，將5個試管中的藻液分別取1毫升加入5個已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后把加熱滅過菌冷卻而尚未凝固的瓊脂培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿，將加了培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿順時針轉(zhuǎn)三次，逆時針轉(zhuǎn)三次，前后搖動兩次，使藻液和培養(yǎng)基混勻。待凝固后，將培養(yǎng)皿放在漫射光下培養(yǎng)，一直到出現(xiàn)藻群落為止，一般來說，在20℃左右，約10天即可出現(xiàn)藻群落。此法操作比較簡單，容易成功。

稀釋法這個方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天輕輕搖動1-2次，搖動時避免培養(yǎng)液沾濕棉花塞。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，藻類生長繁殖數(shù)量較多，再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無其他生物混雜，才達(dá)到分離的目的。如還有其他生物混雜，則再分離，直到獲得單種培養(yǎng)為止。4.平板法（1）平板培養(yǎng)基制備選擇恰當(dāng)?shù)臒o機(jī)培養(yǎng)液，加入1％瓊脂（剪成細(xì)條）放在培養(yǎng)液中浸泡加熱融化，攪拌，并且補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分分裝：冷卻后分裝在培養(yǎng)皿中，約0.3～0.5cm厚滅菌：高壓蒸氣滅菌，間歇蒸氣滅菌（2）噴霧法噴霧法：在無菌條件下用經(jīng)消毒的培養(yǎng)液把水樣稀釋到合適的濃度，裝入消毒好的醫(yī)用喉頭噴霧器中，打開培養(yǎng)皿蓋，把水樣噴射到培養(yǎng)基平面上，使水樣在培養(yǎng)基平面上形成分布均勻的一薄層水珠。蓋上蓋，放在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。（3）水樣稀釋程度水樣稀釋程度水樣噴射的培養(yǎng)基平面上必須相隔1厘米以上才有一個生物（或一個藻細(xì)胞），將來生長繁殖成一群體后容易分離取出。稀釋不夠，將來生成的藻細(xì)胞群落距離太近，不容易分離。（4）劃線法水樣不用稀釋，取金屬接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌后，在液體培養(yǎng)基中冷卻，蘸取水樣輕輕在培養(yǎng)基上做第一次平行劃線3條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度，將接種環(huán)上剩余物燒掉，通過第一次劃線部位做第二次平行劃線，用同法再做第三次和第四次劃線。主要劃線部位不可重疊。由于沾到接種環(huán)上細(xì)胞較多，在第一次劃線部分藻細(xì)胞群落密集分離不開，但在第三、四次劃線部分，可分離出孤立的藻類群落。選直徑5mm的細(xì)玻璃管在酒精噴燈上拉成極細(xì)的微吸管（口徑0.008～0.16mm），將稀釋的藻液置于凹玻片上（或?qū)⑺畼釉谳d玻片上滴成綠豆粒大小的一些水滴，這樣可使每個水滴中有很少生物而便于分離）在解剖鏡下用微吸管吸出所需要的藻種放入另一凹玻片上（用蒸餾水或平衡礦物質(zhì)溶液沖洗數(shù)次），鏡檢這滴水中是否達(dá)到純的要求如不純要反復(fù)數(shù)次，直至達(dá)到分離的目的為止，然后移入滅菌的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)（先導(dǎo)入有培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待生長旺盛后，再擴(kuò)大培養(yǎng)）。5.微吸管法此種方法適合于大型藻類和浮游動物。技術(shù)操作要求高，細(xì)心，吸取一個細(xì)胞要反復(fù)幾次才能成功。用微吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到消毒過的載玻片上，水滴盡可能小，能在鏡下（低倍）看到整個視野的全部水滴或大部分，一個載玻片上放2～4滴，作直線排列，水滴間要有一定的距，如果一滴水內(nèi)有1至幾個所需要的同種藻細(xì)胞，并無其它生物混雜，即用微吸管吸取培養(yǎng)液把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過消毒滅菌的試管或小三角燒瓶中．不成功要反復(fù)做此法簡便，易操作，適宜分離優(yōu)勢種類6.水滴分離法離心法的原理是離心沉淀。將混合藻液放入離心管中離心，水中不同藻類和微生物都向離心管底部下沉，但下沉的速度不一樣，可將藻類分開。離心法分別將不同時間段下沉至管底的藻體取出，通過鏡檢，可選定含所需藻類較多的沉淀物。離心法添加培養(yǎng)液，再次離心，多次反復(fù)以上操作，可獲得具有一定純度的所需藻種。離心法難以獲得單一純種。離心法趨向運動法的原理是借助藻類的趨向性。如某些藻類具有趨光性，在用光照射時，就會向光照處集中，這時即可把集中的藻體取出，移入事先準(zhǔn)備好的另一容器中。趨向運動法對于有鞭毛或具游動孢子的種類，如衣藻、鹽藻、扁藻等，都可以利用此特性來分離藻種。將第一次獲得的藻體部分，移入已消毒的培養(yǎng)液中，再反復(fù)利用這種方法分離，結(jié)果可得到有一定純度的藻體。趨向運動法趨向運動法的分離效果較好，但只能用于運動型微藻。趨向運動法用已消毒的試管5根，第一管裝培養(yǎng)液9ml，第2~5管裝4.5ml，高壓蒸汽滅菌冷卻后，向第1管中加入1ml混合藻液，充分振蕩，使均勻稀釋。稀釋法用滅菌吸管自第1管中吸取0.5m混合液移入第2管，振蕩使均勻稀釋。同法依次移入第3~5管，并都充分均勻稀釋。稀釋法把5個已盛有滅菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，加熱使培養(yǎng)基溶解，待尚未凝固時，將5個試管中的藻液各取1ml分別加入5個培養(yǎng)皿中，再用力搖動培養(yǎng)皿，使藻液和培養(yǎng)基混合均勻。待凝固后，將培養(yǎng)皿放在漫射光下培養(yǎng)，直到出現(xiàn)藻群落。稀釋法一般來說在20℃左右，約10天即可出現(xiàn)藻群落。如果藻群落仍不純，可以反復(fù)進(jìn)行若干次。稀釋法

藻種保存離心法趨向運動法稀釋法平板分離法CBADE單種培養(yǎng)不容易，需要花費很多精力和時間藻種保藏的目的是使藻種能在較長的時間內(nèi)保存下來。需要時可隨時取出使用。有些藻種是選育出來的。一旦藻種分離成功，獲得單種培養(yǎng)后，可供實驗和生產(chǎn)性培養(yǎng)使用。一、為何要進(jìn)行藻種保存？繼代保存請輸入標(biāo)題請輸入標(biāo)題超低溫保存固體培養(yǎng)基保藏液體培養(yǎng)基保藏降溫液氮法玻璃化低溫保存濃縮低溫保存技術(shù)冷凍真空干燥保存法

藻種保存保存方法固液雙相培養(yǎng)基保藏低溫甘油生理鹽水法二1.繼代保存Your

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藻種保存繼代保存是指把藻種接種在單一固體、液體或固-液雙相培養(yǎng)基上,在低溫(是指溫度控制在5～8℃之間)、弱光(通常指在冰箱內(nèi)裝1支8W的日光燈照明)條件下培養(yǎng),一代一代傳下去以延續(xù)“種族”的1種方法,接種1次可保藏半年到1年。2.培養(yǎng)基制備Your

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藻種保存液體培養(yǎng)基通常用消毒海水按常規(guī)配方(例如F/2培養(yǎng)基)配制；固體培養(yǎng)基即平板培養(yǎng)基,作為保藏藻種用的固體培養(yǎng)基,其營養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)按常規(guī)配方增加1倍,用合適的儀器分裝后,加入適量瓊脂,培養(yǎng)液經(jīng)高壓蒸汽滅菌后,取出,試管應(yīng)傾置成斜面,三角燒瓶則平放,冷卻后即成固體培養(yǎng)基。

3.接種三角燒瓶和克氏扁瓶可用接種環(huán)或噴霧法接種。利用醫(yī)用喉頭噴霧器把藻液均勻噴射在培養(yǎng)基平面上。接種方法在超凈工作臺中，把試管的包扎紙和棉塞取下，用滅菌的接種環(huán)蘸取藻液在培養(yǎng)基斜面上做“之”形劃線接種，再把棉塞塞好，貼上標(biāo)簽，綁緊包扎紙。68液體或雙相培養(yǎng)基保藏的藻種,接種后可直接放置低溫、弱光的條件下保藏,也可在適宜光照條件下培養(yǎng)3～4d后再移置低溫、弱光條件下保藏。而僅用固體培養(yǎng)基保藏的藻種,接種后應(yīng)首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng),待藻細(xì)胞生長繁殖達(dá)到較高密度,在平板上可見明顯的條狀或塊狀的藻細(xì)胞群,再移置低溫、弱光的條件下保藏。4.培養(yǎng)保存

藻種保存

固液雙相保藏固液雙相保藏的具體步驟:先將固體培養(yǎng)基滅菌，將滅菌的培養(yǎng)基放置在500C的烘箱中冷卻，向冷卻后未凝固的培養(yǎng)基中注入適量藻液混勻，待培養(yǎng)基凝固后加入滅菌的液體培養(yǎng)基液封，將培養(yǎng)基放置在弱光、陰涼處保藏，此種保藏方式能保藏1年以上。

三、應(yīng)用概況固體培養(yǎng)基優(yōu)缺點YOURTEXT固體培養(yǎng)基保存期較長但容易干涸液體培養(yǎng)基簡便易行,但保存期短；由于簡便易行,目前在生產(chǎn)和科研實踐中,保存藻種最常用的仍是液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基優(yōu)缺點

應(yīng)用概況注意事項作為目前一般實驗室保存藻種的常規(guī)方法,繼代保存簡便易行,設(shè)備簡單,但工作比較瑣碎,耗費時間和精力。在多次的移接過程中,稍有疏忽就會使藻種污染上雜藻、細(xì)菌或原生動物,使保種失敗,而且還會使藻種逐漸老化。為避免這種情況,每1種藻類的保存,至少要保存3種不同年齡的藻種,最早的藻種用于傳代,其余2種以備培養(yǎng)發(fā)生意外時急用。

四、超低溫保存所謂超低溫即指液氮低溫(-196℃),以區(qū)別于其他低溫概念的冰箱溫度(4～-40℃)和干冰溫度(-79℃)。微藻的超低溫保存研究起步較晚,目前普遍采用2步冷凍法,即慢速降溫進(jìn)行冷適應(yīng),然后投入液氮中保存。并且,一般進(jìn)行快速解凍活化復(fù)蘇效果較好。但由于微藻的種類很多,適宜的保存條件各異,如何因種而異,找出不同微藻的超低溫保種方法,應(yīng)是今后努力研究的目標(biāo)。

五、超低溫保存基本原理在液氮低溫-196℃下,生物體的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止,可是它們?nèi)蕴幱诳赡娴某苫顮顟B(tài)。通過添加一定的抗凍保護(hù)劑,防止細(xì)胞在降溫冰凍過程中嚴(yán)重脫水和低溫休克,避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,采用適當(dāng)?shù)谋鶅鏊俣?使細(xì)胞安全地越過冰晶形成危險區(qū)(從細(xì)胞介質(zhì)或原生質(zhì)的冰點到-60℃),進(jìn)入玻璃化狀態(tài),以達(dá)到長期保存的目的。基本原理玻璃化所謂玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過程。玻璃態(tài)固體分子之間的關(guān)系和液態(tài)無明顯變化,水分子停止運動,保持原來的無序狀態(tài),形成堅硬、均勻的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)。玻璃化的細(xì)胞不會出現(xiàn)原生質(zhì)的嚴(yán)重脫水,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,解凍后即可恢復(fù)生長繁殖能力。玻璃化低溫保存1、超低溫保存方法極大地提高冷卻速率增加溶液濃度753、增加溶液濃度保存方法增加溶液濃度沉浸法鏡面接觸法噴濺法76沉浸法噴濺法鏡面接觸法將生物樣品快速地浸入(或彈入)低溫液體中。將低溫液體經(jīng)過噴嘴高速噴濺到生物樣品上,或是將生物樣品的懸浮液高速噴濺進(jìn)入低溫液體中,以達(dá)到樣品被快速冷卻的目的。將生物樣品快速地與某固體鏡面接觸,而此固體鏡面預(yù)先被冷卻至77K或更低溫度。為了達(dá)到高的冷卻速率,要求固體鏡面具有高的導(dǎo)熱系數(shù)和比熱,常用的有銅、銀、藍(lán)寶石等。4、玻璃化概念濃縮低溫保存法Your

text5.濃縮低溫保存技術(shù)將藻液高密度培養(yǎng)后,采用物理、化學(xué)的方法濃縮1000倍左右，再低溫保存。國外自80年代末開始就有對海洋經(jīng)濟(jì)微藻的濃縮方法和低溫保存方法進(jìn)行研究,取得了不少的研究成果，其中美國、英國和日本已有相應(yīng)的產(chǎn)品(微藻濃縮細(xì)胞或稱“藻膏”)問世。蔣霞敏等將小球藻和球等鞭金藻3011(IsochrysisgalbanaPark)濃縮后，在5℃～7℃的冰箱中保存1～3個月后恢復(fù)生長獲得好于常溫的效果。孫建華、王如才（1993）對小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、球等鞭金藻的濃縮和保存方法進(jìn)行了研究,濃縮藻液在1℃～4℃的低溫下加保護(hù)劑SAMs保存3個月,復(fù)蘇后效果良好。濃縮低溫保存多用于海洋微藻。微藻濃縮液的生產(chǎn),可以使海洋微藻的生產(chǎn)與使用保留一定的時間差。但相對保存時間較短，海洋微藻的抗逆原理還有待作更多的研究和探討。冷凍真空干燥保存技術(shù)Your

text6.冷凍真空干燥保存技術(shù)在極低溫度下（-70℃左右）快速冷凍，然后在極低溫度下真空干燥，使藻種的新陳代謝活動處于高度靜止?fàn)顟B(tài)。19世紀(jì)末Fkral與Mudd創(chuàng)立的冷凍真空干燥法是迄今公認(rèn)最佳的藻種保存法,嚴(yán)珍等選擇脫脂牛奶作為保護(hù)劑，將藻液放入安瓿管中，冷凍、干燥并抽真空，火焰熔封。在低溫避光處保存，預(yù)計最大保存年限為18年。冷凍干燥保存法優(yōu)點是微藻復(fù)蘇效果好，保藏期內(nèi)可避免其他雜菌污染，便于攜帶運輸，易實現(xiàn)商品化生產(chǎn)；其缺點是操作繁瑣、對設(shè)備要求高等；應(yīng)用前景十分光明。7、低溫甘油生理鹽水法低溫甘油生理鹽水法是對甘油原液保存法的改進(jìn)。加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，更有利于藻種的保存。在藻液中入一定的甘油作保護(hù)劑,同時加入一定的生理鹽水,混勻后直接放置在-20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存時間長，一般3年左右。從理論上講,以上方法均可用于微藻的保存,但由于所需試驗系統(tǒng)比較復(fù)雜,設(shè)備比較昂貴,玻璃化凍存微藻尚處于起步階段,但它無疑是對微藻超低溫保存的1種新的嘗試?；瘜W(xué)藥品消毒法

在生產(chǎn)性大量培養(yǎng)中，大型容器、工具、玻璃鋼槽和水泥池消毒一般常用化學(xué)藥劑消毒。

1、酒精（C2H5OH）

酒精即乙醇，能使生物體蛋白質(zhì)脫水變性凝固，具有殺菌作用。濃度為70%-75%的酒精殺菌能力最強(qiáng)，常用于小、中型容型的消毒，方法是用紗布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹。容器可在幾分鐘后，用消毒水沖洗。剛沖洗的容器可用純酒精消毒。2、高錳酸鉀（KMnO4）

高錳酸鉀又稱為灰錳氧，為紫色針狀結(jié)晶。易溶于水，是一種強(qiáng)氧化劑，能使蛋白質(zhì)變性，殺菌能力很強(qiáng)。消毒時按10-20mg/L配成高錳酸溶液，容器、工具浸在溶液中5分鐘，取出，用消毒水沖洗2-3次。玻璃鋼水槽和水泥池消毒可用0.05%濃度的高錳酸鉀溶液由池壁頂部淋灑池壁幾遍，并刷洗池底，10分鐘后再用水沖洗干凈。注意浸泡高錳酸鉀的時間不能過長，如果超過1小時，容器、工具上有棕褐色的沉淀，很難洗去。高錳酸鉀溶液一般應(yīng)當(dāng)天配當(dāng)天使用。

3、石炭酸（苯酚C6H5OH）

石炭酸主要破壞生物細(xì)胞膜，并使蛋白質(zhì)變性。水毒按3%-5%，的比例配成溶液，把洗刷的容器、工具放在溶液中浸泡半小時，用消毒水沖洗2-3次。4、鹽酸（HCl）

取工業(yè)用鹽酸1份，加淡水9份，配成10%的鹽酸溶液。容器、工具放入鹽酸溶液中浸泡5分鐘，后用消毒水沖洗2次。也可用來消毒水泥池或其他容器。漂白粉白色粉末狀物質(zhì)，是氯與氫氧化鈣作用的產(chǎn)物。在空氣中因受二氧化碳作用，逐漸放出次氯酸而有強(qiáng)烈的刺激性氣味。工業(yè)上用的漂白粉一般含有效氯為30%-35%，消毒時按0.01%-0.03%的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小時再用消毒水（經(jīng)過煮沸或沉淀過濾的水）沖洗三四次即可。白瓷磚池、水泥池的消毒可配成高濃度漿糊狀的漂白粉溶液淋灑池壁，半小時后用消毒水沖洗干凈。為充分消毒培養(yǎng)池，也可用較低量的漂白粉進(jìn)行全池浸泡后用消毒水沖洗干凈。漂白粉有氯臭味，需要停放12小時才能接種使用（一般下午消毒池子，明天早上接種），以免抑制培養(yǎng)單胞藻的生長。漂白精也可用漂白精進(jìn)行消毒，漂白精主要成分是氯化鈉和次氯酸鈉，漂白液含有一定量的NaClO，有效氯100g/L（5%）以下，是工業(yè)上用電解飽和NaCl溶液的方法來制取NaOH、Cl2和H2，并以它們?yōu)樵仙a(chǎn)一系列化工產(chǎn)品，稱為氯堿工業(yè)化工廠的副產(chǎn)物。由于漂白液具有價格低廉、無大型雜質(zhì)、不產(chǎn)生沉淀物及便于儲藏和用法簡單等優(yōu)點，被育苗場廣泛地用于容器、工具和培養(yǎng)池的消毒。使用時可參照漂白液的用量進(jìn)行具體調(diào)整。微黃色溶液，有似氯氣的氣味漂白粉是一種強(qiáng)氧化劑，能使蛋白質(zhì)變性，殺菌能力強(qiáng)，殺菌的主要成分是氯。漂白粉消毒法常常將洗凈的容器、工具等在19%~5%的漂白粉懸濁液中浸泡半小時，再用消毒水沖洗23次。一般來說，消毒效果隨浸泡時間增加而增強(qiáng)。漂白粉消毒法用于玻璃鋼水槽、水泥池的消毒處理時，操作方法同高錳酸鉀溶液消毒法。漂白粉消毒法漂白粉消毒水是比較徹底的方法。生產(chǎn)上常用的具體做法是，用市售的漂白粉（含有效氯約30%）以80~100mg/L處理消毒12~24h，加入硫代硫酸鈉60~80mg/L，2h后即可使用。漂白粉消毒法PointA容器與工具的消毒PointB培養(yǎng)用水的消毒消毒物理消毒請輸入標(biāo)題請輸入標(biāo)題煮沸消毒請輸入標(biāo)題請輸入標(biāo)題一、容器與工具的消毒化學(xué)消毒加熱消毒直接灼燒消毒烘干箱消毒紫外線消毒酒精消毒高錳酸鉀消毒鹽酸消毒漂白粉消毒為了防止單細(xì)胞的污染，培養(yǎng)用的容器和工具都必須經(jīng)過消毒。消毒和滅菌的定義是有區(qū)別的。滅菌是指殺死一切微生物，包括營養(yǎng)體和芽孢.消毒則只殺死營養(yǎng)體，不殺死芽孢。加熱消毒法是利用高溫殺死微生物的方法。因此，不耐高溫的容器、工具如塑料和橡膠制品不能用此法消毒。（一）物理消毒直接在酒精燈火焰上短暫灼燒。簡單、方便、快速、效果好，但只適用于小型金屬或玻璃工具，如接種環(huán)、鑷子、小刀、試管口、瓶口等；2.直接灼燒滅菌1.加熱消毒2.直接灼燒滅菌接種環(huán)、鑷子等金屬小工具，試管口、瓶口等可以直接在酒精燈火上灼燒滅菌。載玻片、小刀等則最好先蘸酒精，然后再酒精燈火焰上點燃，等器具上的酒精燒光，也就完成了滅菌操作。直接灼燒滅菌可以直接將微生物燒死，滅菌徹底。3.煮沸消毒把小型工具或容器用紗布包好放入鍋中，加水煮沸消毒，一般煮沸15分鐘～30分鐘。大型錐形瓶消毒，可在瓶口上放一只普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一稱量瓶蓋或表面皿，在錐形瓶內(nèi)加入少量淡水，置電爐上加熱煮沸15～30分鐘，可使整個瓶壁消毒，同時冷凝水回滴入錐形瓶。消毒完畢即用牛皮紙或消毒的紗布蓋在瓶口。煮沸消毒鍋4.烘箱干燥消毒烘箱亦稱恒溫干燥箱。將玻璃容器、金屬工具等用水清洗后，用牛皮紙包扎后放入烘箱，關(guān)閉烘箱門，打開箱頂?shù)耐饪?，接通電源。?dāng)溫度上升到120℃時，關(guān)閉通氣孔，繼續(xù)加熱至溫度達(dá)到120～170℃，恒溫烘烤2小時，然后停止加熱，待烘箱溫度自然降至60℃以下打開烘箱門取出消毒后的器具。5.紫外線消毒法消毒使用的紫外線是C波紫外線，其波長范圍是200－275nm，殺菌作用最強(qiáng)的波段是250－270nm，紫外線消毒的最適宜溫度范圍是20－40℃，溫度過高過低均會影響消毒效果，可適當(dāng)延長消毒時間，用于空氣消毒時，消毒環(huán)境的相對濕度低于80％為好，否則應(yīng)適當(dāng)延長照射時間。一般紫外線照射20-30分鐘，即可起到消毒作用。注意事項：不得使紫外線光源照射到人，以免引起損傷。紫外燈二、化學(xué)藥品消毒能使生物蛋白質(zhì)脫水變性凝固。一般用濃度70％的酒精。用于一級培養(yǎng)的中、小型容器的消毒。是一種強(qiáng)氧化劑，使蛋白質(zhì)變性，殺菌能力很強(qiáng)。10～20ppm，5～10min。用于二、三級容器、工具。酒精（C2H5OH）高錳酸鉀（KMnO4）鹽酸消毒配置鹽酸工業(yè)鹽酸鹽酸取工業(yè)用鹽酸1份，加淡水9份，配成10%的鹽酸溶液。容器工具放入鹽酸中浸泡5min，后用消毒水沖洗2次，主要對玻璃培養(yǎng)瓶的消毒。102Your

text漂白粉Ca（ClO）2又稱氯石灰，在水中釋放氯氣和初生氧，有強(qiáng)殺菌作用。成本低，消毒也比較徹底，是生產(chǎn)上二、三級培養(yǎng)池和大型容器、工具常用的消毒方法。

漂白粉消毒Your

text工業(yè)用漂白粉一般含有效氯30～35％，消毒時按100～300ppm的有效氯含量配成水溶液，容器、工具浸泡30min以上，消毒水沖洗2～3次即可；培養(yǎng)池消毒，用高濃度漿糊狀灑淋池壁，半小時后用消毒水沖洗干凈。010203能夠達(dá)到殺滅敵害生物目的消毒處理后海水必須無毒消毒方法經(jīng)濟(jì)、簡單、易行培養(yǎng)用水消毒為了防止敵害生物污染，配制培養(yǎng)液的海水必須經(jīng)過消毒，殺死其中的敵害生物。培養(yǎng)用水常用的消毒方法有過濾、加熱、化學(xué)消毒劑和紫外線消毒等幾種。選用消毒方法應(yīng)考慮下列三方面的情況：1.加熱消毒把經(jīng)沉淀的或沉淀后再經(jīng)砂濾的海水于燒瓶或鋁鍋中煮沸消毒。海水加熱消毒，冷卻后須經(jīng)充分?jǐn)嚢杌蛘鹗?，使其恢?fù)溶解氣體量。通常保種培養(yǎng)用水多用加熱消毒法進(jìn)行消毒。2.過濾除菌法把經(jīng)沉淀的海水，經(jīng)砂過濾裝置(砂濾池或砂濾罐)過濾，把大型的生物的非生物雜質(zhì)除去，再經(jīng)陶瓷過濾罐過濾，除去微小生物。還有雙過濾裝置，使海水經(jīng)過兩次過濾，除菌更有保證。砂濾裝置，濾水迅速、濾水量大，在微藻的大量培養(yǎng)中使用，能滿足大量用水的需要。但是微小生物不能完全隔除，除菌不徹底是砂濾的缺點。為了克服這一缺點，可采用兩次砂濾、陶瓷過濾罐過濾或進(jìn)行水的再消毒處理。沙濾罐陶瓷過濾罐106Your

text1)量取濃鹽酸84毫升，加蒸餾水(或用淡水代替)916毫升，配成一個摩爾濃度的鹽酸溶液。2)稱取氫氧化鈉40克，溶解于1000毫升蒸餾水(或用淡水代替)中，配成一個摩爾濃度的氫氧化鈉溶液。

3.酸處理消毒Your

text根據(jù)所需處理水量的多少，按每1000毫升海水加一個摩爾濃度的鹽酸溶液3毫升的比例，加酸充分?jǐn)嚢?。加酸后海水的PH值可降到3左右(PH值2.9-3.1)。酸處理12小時以上，一般下午開始酸處理到次日上午止。處理完畢，再按每1000毫升海水加入一個摩爾濃度的氫氧化鈉溶液3毫升的比例，加堿中和，使海水的PH值恢復(fù)到7.5-8.0左右。然后立即施肥，接種培養(yǎng)。酸堿溶液配制酸處理4.漂白粉或漂白液消毒海水經(jīng)沉淀及砂過濾裝置過濾后流入海水消毒池，使用漂白粉或漂白液消毒。目前生產(chǎn)上最常用的是漂白粉[Ca(ClO)2]和漂白液(NaClO)。漂白粉起消毒作用的成分是其中所含的有效氯。市面上出售的漂白粉，其有效氯含量一般為30%-35%，漂白精的有效氯含量一般為60%-70%，比漂白粉高一倍。這種氯含量極不穩(wěn)定，易與空氣中的二氧化碳化合而不斷消失，同時也容易從空氣中吸收水分而潮解成半流動體，并很快分解產(chǎn)生次氯酸而散逸。如果產(chǎn)品出廠后經(jīng)過的時間較長，儲藏又不嚴(yán)密，就很容易失去消毒作用。因此在使用時，若不預(yù)先測定其有效氯含量，而僅以出廠時標(biāo)明的氯含量來計算漂白粉使用量，往往達(dá)不到預(yù)期效果。消毒時，直接向水中加入漂白粉或漂白液，使有效氯含量達(dá)到25×10-6左右，停放6-7小時，可將水中的細(xì)菌、雜藻、原生動物等殺死。使用前，需要用硫代硫酸鈉(Na2S2O3)進(jìn)行中和。在生產(chǎn)上用硫酸——碘化鉀——淀粉試劑作為指示劑，先計算出理論上所需硫代硫酸鈉的量，將此數(shù)據(jù)作為參考，逐漸往里加，邊加邊攪動，加到一大半時，用指示劑測定，若變成藍(lán)色，則說明還有余氯需要繼續(xù)中和;當(dāng)?shù)渭又甘緞o蘭色出現(xiàn)時，說明中和徹底。有些生產(chǎn)單位用碘化鉀溶液作為指示劑，若溶液變黃，則說明還有余氯需要中和，這種方法雖然在理論上成立，但容易在視覺上產(chǎn)生誤差，造成水的中和不徹底，影響微藻的培養(yǎng)效果，不應(yīng)提倡。使用方法漂白粉使用量關(guān)于消毒海水時漂白粉或漂白液的用量，可根據(jù)實際情況確定。用25×10-6有效氯的漂白粉或漂白液消毒海水，可以殺死大部分?jǐn)澈ι?，但對危害?yán)重的大型變形蟲無法殺滅。用100×10-6有效氯的高濃度漂白粉或漂白液消毒，可以殺死包括大型變形蟲在內(nèi)的一切敵害生物。敵害生物的出現(xiàn)具有季節(jié)性，一般以6-9月份為敵害生物危害嚴(yán)重季節(jié)，可以在些季節(jié)內(nèi)用較高濃度的漂白粉或漂白液消毒海水。而在冬季和初春(敵害生物較少出現(xiàn))，可用較低濃度的漂白粉或漂白液消毒，力求降低生產(chǎn)成本。漂白粉消毒海水(或淡水)是生產(chǎn)上最常用的方法，成本較低，消毒也比較徹底。紫外線消毒水的原理，系海水經(jīng)一定量煞費苦心的照射產(chǎn)生臭氧，而臭氧產(chǎn)生的原子態(tài)氧具有較強(qiáng)的氧化作用，從而殺死海水中的部分微生物和某些藻類。這種消毒方法經(jīng)濟(jì)、殘余的有害物質(zhì)少。但設(shè)備較為昂貴，水流量不易控制，須有專人看管;否則，易燒壞紫外線燈管。有條件的單位可以考慮使用。砂濾海水以一定的流速經(jīng)過紫外線消毒器，即可完成海水的消毒;或向消毒池海水充以經(jīng)紫外線照射的空氣，也可實現(xiàn)海水的消毒。加熱消毒法加熱消毒法是利用高濕使蛋白質(zhì)變性以殺死微生物的方法。不能時高溫的容器和工具，如塑料、橡膠制品等不能用此法消毒。加熱消毒法加熱消毒法加熱消毒法0102直接灼燒滅菌03煮沸消毒烘箱燥消毒加熱消毒法直接灼燒滅菌接種壞、鑷子等金屬小工具，試管口、流口等可以直接在酒精燈火焰上短暫灼燒滅菌。加熱消毒法加熱消毒法煮沸消毒把小型容器和工具用紗包好，放入鈉中，加水煮沸消每，一般約煮沸1530min，可殺死細(xì)菌的營養(yǎng)體。加熱消毒法加熱消毒法烘箱燥消毒此方法是實驗室中常川的干熱滅菌法。將清洗過的玻璃容器、金屬工具等用報紙或牛皮紙包好，均勻地放入烘箱：般加熱至120-170℃維持2h即可達(dá)到目的。加熱消毒法加熱消毒法實驗三單細(xì)胞培養(yǎng)容器、器具、用水消毒一、【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)單細(xì)胞藻的容器工具及用水的消毒方法,為今后成功培養(yǎng)單細(xì)胞藻打基礎(chǔ)。二、【實驗原理和基礎(chǔ)知識】單細(xì)胞藻培養(yǎng)用的工具、容器及水都必須經(jīng)過嚴(yán)格消毒,盡可能殺死一切生物,以免污染影響藻類生長和繁殖。。三、實驗用品：1、實驗器材儀器設(shè)備:恒溫干燥箱、電爐、電子天平、充氣泵工具容器:250ml三角燒瓶(每人2只)400ml燒杯30只3000ml三角燒瓶10只(6人/組)攪拌棒20根移液管(5或10ml)30支塑料桶4個移液管(1ml)30支乳膠管若干容量瓶(100ml)30只量筒100ml30只2、藥品濃硫酸、重鉻酸鉀、漂白水或次氯酸鈉溶液、硫代硫酸鈉。洗液的配制方法:稱15g重鉻酸鉀至干燥的燒杯中,然后加入200ml粗硫酸,攪拌并加熱至重鉻酸鉀溶解,即得洗液,冷卻后將上清液倒入試劑瓶中備用。3、實驗材料海水200L、淀粉碘化鉀試紙2包、充氣管、充氣石10粒。四、實驗操作步驟3.煮沸消毒小型的容器、工具可放入鍋中,加水煮沸消毒15-30min,可殺死細(xì)菌的營養(yǎng)體,如果在水中加入2%Na2c03可促使芽孢死亡。較大的三角燒瓶,可在瓶內(nèi)加少量淡水,套上紙或放一只普通的玻璃漏斗,煮沸消毒15-30min,可使整個瓶壁消毒。然后倒出淡水,蓋上消毒的牛皮紙。、外壁。一、工具、容器消毒方法1.洗液消毒法所有待用三角瓶、燒杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自來水(加去污粉)沖刷干凈,然后倒入少許洗液,沿著內(nèi)壁慢慢轉(zhuǎn)動器皿,使其全部浸泡,放置10min后,將底部洗液回收(以備后用),然后用自來水沖凈瓶子,把瓶口朝下晾干。移液管應(yīng)用洗耳球吸取洗液,使其浸泡內(nèi)壁,10min后,用自來水沖凈內(nèi)2.烘箱干熱消毒法將洗凈、涼干的玻璃器皿(移液管、金屬工具等應(yīng)用報紙或牛皮紙包扎好),扎瓶口用的紙,棉塞均放入烘箱。打開通氣孔,接通電源,加熱,待溫度上升120℃時關(guān)閉通氣孔(在升溫過程中,如果綠燈熄滅,紅燈亮,表示箱內(nèi)停止加熱),恒溫2h后,斷電停止加熱,然后待溫度自然冷卻至60℃以下,才能打開烘箱門取出容器、工具(實驗室保種通常并用洗液消毒法和加熱消毒法)。3.漂白水消毒法每人取2L過濾海水加入漂白水(含有效氯10%)0.5ml,攪拌均勻后蓋上以防氯氣逸出。靜止放置16-24h時消毒后再加入等量硫代硫酸鈉中和,充氣2h,然后用淀粉碘化鉀試紙測試是否有余氯(單胞藻二級培養(yǎng)、三級培養(yǎng)常用)。試紙無變藍(lán)表明無余氯存在,即可使用。培養(yǎng)用水的消毒方法1.脫脂棉過濾法取一桶海水置于高處,接好過濾裝置、然后控制夾子,慢慢滴水過濾2L.2.加熱煮沸消毒法將經(jīng)脫脂棉過濾的海水,放至電爐燒開,冷卻至室溫(實驗室保種通常并用脫脂棉過濾和加熱煮沸法)。1.用加熱法消毒培養(yǎng)用水時,三角瓶內(nèi)的水量不能超過瓶子的2/3,瓶外面不能有水珠,瓶口用紙蓋住,不要綁緊。2.洗液在瓶子內(nèi)轉(zhuǎn)動時,注意瓶口不能對著自己,也不能對著他人。3.干熱滅菌過程中,實驗者不能離開,嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。4.烘箱內(nèi)的溫度需冷卻至60℃以下,才能打開烘箱門取出工具、容器。1.培養(yǎng)單細(xì)胞藻的工具、容器的消毒有哪幾種方法?2.單細(xì)胞藻培養(yǎng)用水的消毒有哪幾種方法?3.單細(xì)胞藻藻種應(yīng)如何保藏?注意事項作業(yè)與思考作為保藏藻種用的固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)濃度應(yīng)按配方增加1倍。制備固體培養(yǎng)基保種用的容器有試管、三角燒瓶、克氏扁瓶等，以15ml試管和250ml三角燒瓶最常用。試管的培養(yǎng)基分裝量約為試管長度的1/5，三角燒瓶和克氏扁瓶的培養(yǎng)基分裝厚度為0.5~0.8cm。制備固體培養(yǎng)基分裝時應(yīng)避免培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，分裝后須塞上棉花塞，再用紙包扎。制備固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，取出，試管斜置以形成斜面，三角燒瓶和克氏扁瓶則平放，自然冷卻，即成固體培養(yǎng)基。制備固體培養(yǎng)基培養(yǎng)液制備3培養(yǎng)液成分

營養(yǎng)元素的濃度培養(yǎng)液配方培養(yǎng)液配制配制培養(yǎng)液是根據(jù)培養(yǎng)藻類對營養(yǎng)的要求，選用合適的配方，在消毒水中按配方加入各種營養(yǎng)物質(zhì)。214（1）特異性（2）共性不同的單胞藻，對營養(yǎng)元素的需求有所不同，同時，不同的營養(yǎng)元素及不同的營養(yǎng)鹽的種類對不同的單胞藻所起的作用也有所差別。各種藻類對營養(yǎng)的需要有很多共同點。一些培養(yǎng)液的配方，能應(yīng)用于多種藻類的培養(yǎng)。

1.培養(yǎng)液的成分123456不是所有單胞藻培養(yǎng)液都必須具備這七類成分，其中最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和輔助生長有機(jī)物質(zhì)，其他成分只在某些培養(yǎng)液配方中使用其中的一類或兩類。培養(yǎng)液主要成分大量元素微量元素輔助生長有機(jī)物質(zhì)土壤抽出液絡(luò)合劑植物生長調(diào)節(jié)劑緩沖劑7必需元素必需元素是單胞藻在生長發(fā)育過程中不可缺少的元素。按其存在于植物體內(nèi)的數(shù)量多寡分為大量元素和微量元素。二者具有同等的重要性，而且不能相互替代，對于植物的生長和發(fā)育都各有其一定的功能，各元素之間也存在著一些作用。微量元素在培養(yǎng)液中所需量很小，但又不能沒有。碳、氫、氧3種可從水、空氣中取得，氮、磷、鐵3種要從水中或土壤中的若干化合物中取得，來源不及前3種豐富，人工培養(yǎng)時必須補(bǔ)充。在人工培養(yǎng)中，需補(bǔ)充的大量元素主要是氮、磷、鐵、硅

4種元素。在大量元素中，其中最重要、需要量較大的有碳、氫、氧、氮、磷、鐵等6種。素大量元素也叫主要營養(yǎng)元素或主要元素。大量元硅源及其效用040102大量元素來源用效用氮源及其效用鐵源及其效用03磷源及其效用

05其他元素氮是植物蛋白質(zhì)的主要組成成分，對植物的生長發(fā)育具有重要的意義。氮源是否充足對微藻的培養(yǎng)至關(guān)重要。生產(chǎn)上常用的氮源：硝酸鉀（KNO3）硝酸鈉（NaNO3）硝酸銨（NH4NO3）硝酸鈣[Ca（NO3）2]尿素[（NH2）2CO]氯化銨（NH4Cl）硫酸銨[（NH4）2SO4]發(fā)酵人尿氮源及其效用單胞藻對氮元素的利用（1）氮元素的存在形式無機(jī)態(tài)氮：硝酸態(tài)氮（NO3--N、NO2--N）銨氮（NH4+-N、NH3-N）有機(jī)態(tài)氮：尿素有效氮：能被藻類利用的無機(jī)態(tài)或有機(jī)態(tài)氮。（2）氮的轉(zhuǎn)化①氨化作用：含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)氮②硝化作用：銨氮轉(zhuǎn)化為硝酸態(tài)氮；③脫氮作用：缺氧情況下，硝酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化為NO2或N2。單胞藻對氮的吸收方式不同的藻類對硝酸態(tài)氮和銨氮的吸收利用情況不同。大多數(shù)單胞藻能吸收無機(jī)態(tài)氮，但對硝酸態(tài)氮和銨氮吸收的速度和利用的情況有差異，優(yōu)先吸收銨氮（吸收完后再吸收NO3—N）。少數(shù)藻類（如小球藻等）能吸收有機(jī)態(tài)氮。硝酸態(tài)氮培養(yǎng)單胞藻較好。培養(yǎng)小球藻，尿素的效果比硝酸鹽好。生產(chǎn)中，一般一級培養(yǎng)多用硝酸鉀和硝酸鈉，二三級培養(yǎng)多用尿素。應(yīng)盡量避免使用會導(dǎo)致藻液中銨氮上升的氮源。硝酸態(tài)氮缺點①往往會引起脫氮作用（NO3

缺O(jiān)N2）。②有銨氮存在時，會影響吸收。銨氮缺點①具毒害作用。特別是對養(yǎng)殖對象的毒害遠(yuǎn)超硝酸態(tài)氮，當(dāng)其在水中濃度超過0.025ppm就對魚類有毒害作用；②微量銨氮存在，會影響硝酸態(tài)氮和有機(jī)態(tài)氮的吸收，造成這些氮的浪費；③銨氮優(yōu)先吸收，但吸收后的生長率并不比硝酸態(tài)氮和有機(jī)態(tài)氮好。尿素缺點①對某些藻類有毒害作用；②后吸收；③有NH3-N存在時，尿素效用大大減弱；

硝酸態(tài)氮、銨氮和尿素缺點磷源及其效用磷是組成核酸、能量轉(zhuǎn)換物質(zhì)、脂類物質(zhì)和維生素等不可缺少的元素之一，對植物的生命活動有重要意義。生產(chǎn)中常用磷源：磷酸二氫鉀（KH2PO4）磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（其次）磷酸二氫鈉（NaH2PO4）磷酸氫二鉀（K2HPO4）過磷酸鈣重過磷酸鈣磷酸銨（商品名：安福粉）溶解磷：不溶解磷：活性磷：非活性磷：能通過某種固定超濾膜過濾的磷不能通過某種固定超濾膜過濾的磷

能被鉬蘭法測定出來的磷不能被鉬蘭法測定出來磷單胞藻對磷元素的利用鐵源及其效用鐵是植物體內(nèi)許多氧化酶所必需的一種元素，且有促進(jìn)葉綠素作用。常用鐵源：三氯化鐵（FeCl3）硫酸亞鐵（FeSO4）硫酸高鐵[Fe2（SO4）3]氧化鐵（FeO）檸檬酸鐵（FeC6H5O7）檸檬酸鐵銨[（Fe（NH4）3（C6H5O7）]鐵元素存在形式往往是不溶態(tài)的鐵，在水中容易形成一種膠體復(fù)合物，不能為生物利用，同時容易與其他離子結(jié)合形成沉淀。

單胞藻對鐵元素的利用可溶性，易為藻類細(xì)胞利用。無機(jī)態(tài)鐵有機(jī)態(tài)鐵微藻對鐵的需要量很小，但要滿足這種需要卻比其他營養(yǎng)元素更為困難。加某種有機(jī)酸或其鹽類以形成可溶性鐵化合物。常用有蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸等。加土壤抽出液。因腐殖酸的作用可阻止鐵的沉淀和溶膠化。加絡(luò)合物防止鐵和微量元素發(fā)生沉淀。常用EDTA-Na2（乙二胺四乙酸鈉鹽）無機(jī)態(tài)鐵改善利用聚縮磷酸鹽反應(yīng)。使不溶態(tài)鐵轉(zhuǎn)化為溶態(tài)鐵。使用有機(jī)態(tài)鐵代替無機(jī)態(tài)鐵。硅源及其利用單胞藻中，特別是硅藻，不但細(xì)胞壁（硅酸占96.5％）需要大量的硅酸來形成，在整個生長發(fā)育中（尤其在分裂時）都需要硅，而且不能由其它元素來代替。常用硅源：硅酸鈉（Na2SiO3）硅酸鉀（K2SiO3）偏硅酸鈉（NaSiO3·9H2O）更高度聚合形式的硅化合物不能為硅藻所利用。其它元素鉀、鈣、鎂、硫的來源與效用鉀在生物體內(nèi)的主要作用不是結(jié)構(gòu)功能，而是代謝功能。它能使原生質(zhì)膠體保持一定程度的膨脹，且對光合作用、碳水化合物和蛋白質(zhì)的合成有一定促進(jìn)作用；鈣能調(diào)節(jié)原生質(zhì)的活動和植物體內(nèi)的酸堿反應(yīng)；鎂是葉綠素的主要組成物質(zhì)，同時又常與磷酸結(jié)合，對植物的生命活動過程起調(diào)節(jié)作用；硫是蛋白質(zhì)的重要組成成分之一。鉀、鈣、鎂、硫元素在培養(yǎng)液中一般不需要單獨加入。原因：（1）海水中的自然含量比較豐富，一般能滿足要求。（2）在加入其他營養(yǎng)鹽的同時，附帶加入了該元素。如加入KNO3在補(bǔ)充了氮元素的同時也補(bǔ)充了鉀元素。常用鉀源：氯化鉀（KCI）、硝酸鉀（KNO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4

）常用鈣源：氯化鈣（CaCI2）、硝酸鈣[Ca（NO3）2]常用鎂源：硫酸鎂（MgSO4）、氯化鎂（MgCI2）常用硫源：硫酸銨、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳等。微量元素常用微量元素化合物（P59）硼（B）：硼酸（H3BO3）硼砂（Na2B4O7·10H2O）（焦性硼酸鈉）錳（Mn）：硫酸錳（MnSO4）、氯化錳（MnCl2）、氧化錳（MnO）鋅（Zn）：硫酸鋅（ZnSO4）、氯化鋅（ZnCl2）銅（Cu）：硫酸銅（CuSO4）、氯化銅（CuCl2）鉬（Mo）：鉬華（MoO3）鉬酸銨[（NH4）2O·7MoO3]常用微量元素化合物鈷（Co）：氯化鈷（CoCl2）鈦（Ti）：氯化鈦（TiCl2）鎢（W）：鎢酸鈉（Na2WO4）鉻（Cr）：硫酸鉻鉀[CrK(SO4)2]、鉻酸鉀（K2CrO4）鎳（Ni）：硫酸鎳（NiSO4）釩（V）：釩酸鈉（NaVO3）、釩酸銨（NH4VO3）鎘（Cd）：氯化鎘（CdCl2）鍶（Sr）：硫酸鍶（SrSO4）輔助生長有機(jī)物質(zhì)輔助生長有機(jī)物質(zhì)：培養(yǎng)液中對單胞藻的生長有輔助促進(jìn)作用的有機(jī)物質(zhì)。目前常用的有4類：（1）維生素類：維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素H、生物素、煙酸、葉酸等。其中對單胞藻類影響較顯著的是B族維生素，尤其對等鞭金藻的培養(yǎng)非常重要。（2）抗生素類：鏈霉素、紅霉素、土霉素、金霉素等?？股貙伟迳L有促進(jìn)和抑制兩方面的作用，目前對它的研究較弱，生產(chǎn)上尚未大量使用。（3）生長素和生長物質(zhì)類：萘乙酸、吲哚乙酸、赤霉素、秋水仙素、核酸等。（4）其他：葡萄糖、有機(jī)酸鹽、肝抽出物、酵母抽出物、貝肉湯、魚粉、咸魚汁、氨基酸等。

土壤抽出液

土壤抽出液除含有無機(jī)微量元素外，還含有某些單胞藻類需要的輔助生長有機(jī)物質(zhì)（腐殖酸及其鹽類）。培養(yǎng)液中加入適量的土壤抽出液，一般能獲得良好效果，尤其是對一些較難培養(yǎng)的種類，常能獲得培養(yǎng)成功。土壤抽出液因處理過程不同，其營養(yǎng)的成分和數(shù)量變化較大。（1）取用土壤或海泥時，必須固定地方，不要經(jīng)常更換。（2）對培養(yǎng)效果和使用量，均應(yīng)通過培養(yǎng)試驗來掌握了解。土壤抽出液的制作土壤1千克加1升純水，煮沸60分鐘，暗處放置兩天后過濾，取濾液500毫升加純水400毫升使用。土壤1千克加純水1升，再加入NaOH2～3克，煮沸120分鐘，冷卻過濾后使用。土壤抽取液I

土壤抽取液Ⅱ土壤抽出液的制作土壤1千克加純水2升，煮沸煎濃，次日取上清液再煮沸煎濃，第三天如法炮制，直到得到1000毫升深褐色土壤抽取液。取海灘上砂質(zhì)較少，有機(jī)質(zhì)較多而又不是過分淤黑的上層軟泥，清除其中的小石塊等雜物，以容量計算一份海泥加海水或淡水2份，靜置1～2分鐘，棄去底部粗砂、小石塊等雜物，按每1000毫升泥漿加入1克氫氧化鈉的量加入氫氧化鈉，煮沸20—30分鐘，靜置24小時取上清液使用。土壤抽取液Ⅲ

海泥抽取液絡(luò)合劑絡(luò)合劑的主要作用是使之與無機(jī)態(tài)鐵等微量金屬離子結(jié)合形成絡(luò)離子，以防產(chǎn)生沉淀。絡(luò)合離子能根據(jù)質(zhì)量作用定律不斷釋放出金屬離子為微藻所吸收利用。最常用的絡(luò)合劑有：乙二胺四乙酸（EDTA）或其鈉鹽（EDTA-2Na）

植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑：又稱植物生長激素，有促進(jìn)藻類細(xì)胞生長繁殖的作用。營養(yǎng)元素的濃度單胞藻培養(yǎng)液中營養(yǎng)元素的濃度依單胞藻的種類、培養(yǎng)目的、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件等情況的不同而各不相同。但在一個大體范圍內(nèi)又具有許多共同點。生產(chǎn)上主要施加氮、磷、鐵、硅四種元素，一般根據(jù)不同的情況選用低量、中量、高量三種不同的濃度。氮、磷、鐵、硅的濃度單位：ppm元素低量中量高量氮5-1515-30＞80KNO33-50100-200400-500磷0.1-11-4＞4K2HPO41-510-20200鐵0.02-0.040.05-0.1＞0.3FeCl30.10.2-0.30.8-1硅2-1520-70Na2SiO310-50根據(jù)元素濃度，通過分子量換算出化合物的濃度培養(yǎng)液的配方一些培養(yǎng)液配方是較普遍適用的，有一些是針對某一種或幾種單胞藻而定的。有些配方只要加入幾種特需的營養(yǎng)元素就可適用不同的單胞藻類。生產(chǎn)中培養(yǎng)液的配方，常以這些配方為基礎(chǔ)，再結(jié)合實際情況不斷進(jìn)行調(diào)整。一般控制主要元素濃度之間的比例為：N：P：S：Fe=10：1：1：0.1培養(yǎng)液的配制母液：為減少每次稱量的麻煩，根據(jù)配方配成的濃營養(yǎng)溶液。母液是培養(yǎng)液的濃縮。通常在配制培養(yǎng)液時以每1000mL水中加入母液1mL為宜(1:1000)。如配方中KNO3

用量為100g/L，母液每毫升就應(yīng)含KNO30.1g。貯液：固體營養(yǎng)元素為減少每次稱量的麻煩和使用方便而配成的重量百分比溶液。如配1％KNO3

貯液，100ml水加1gKNO3

。貯液可以是單項營養(yǎng)元素配成，也可以是兩種或多種營養(yǎng)元素同配而成，但要盡量防止沉淀。培養(yǎng)液的配制用水培養(yǎng)液的配制有用純水（無離子水或蒸餾水）和天然淡、海水配制兩種方法。用純水配制的培養(yǎng)液，營養(yǎng)元素種類必須齊全，使用的化合物較多，主要用于科學(xué)研究或保種，而一般的實驗室培養(yǎng)和生產(chǎn)性培養(yǎng)都使用天然淡、海水配制。天然淡、海水是水生生物長期適應(yīng)于其中生活的優(yōu)良環(huán)境，已存在著植物需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，因此在配制時只需增加某些在培養(yǎng)中可能引起缺乏的營養(yǎng)元素就成。在生產(chǎn)性大量培養(yǎng)中往往只加入最主要的幾種營養(yǎng)元素，且不要求使用純度較高的化學(xué)試劑，可使用工業(yè)純和農(nóng)肥。培養(yǎng)液配制中的注意事項1、保種用的營養(yǎng)鹽應(yīng)用試劑級（A·R或C·P）。一般生產(chǎn)性培養(yǎng)只需選用純和工業(yè)純。藥品試劑規(guī)格保證試劑：G.R分析純：A.R化學(xué)純：C.P純：藥典規(guī)格工業(yè)純：雜質(zhì)較多2、營養(yǎng)元素的加入要有一定的順序，一般先加N，再加P，后加Fe。同時，F(xiàn)e應(yīng)在EDTA之后加。3、維生素溶液的配制要將各種維生素分別溶解后再混合。若培養(yǎng)用水是加熱消毒，一定要待冷卻后才能加入。4、每加入一種營養(yǎng)元素，要攪拌均勻后再加入第二種。培養(yǎng)基的組成因光合細(xì)菌的種類而異，但主要包括：培養(yǎng)基配置

水分

氮源（無機(jī)氮和有機(jī)氮）

碳源（有機(jī)化合物和碳?xì)浠衔铮┢浯?，需加入一定量的微量元素：培養(yǎng)基配置

銅、鉀、鎂、硫、磷、氯等

以無機(jī)鹽形式添加

有些還需添加生長因子

（B族維生素和某些氨基酸或核酸）為了保證細(xì)菌正常生長，培養(yǎng)基還應(yīng)維持適當(dāng)?shù)膒H。培養(yǎng)基配置一般細(xì)菌在中性至微堿的培養(yǎng)基中生長良好，但也有的在酸性或堿性培養(yǎng)基中生長得更好。由于有些培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后pH還會發(fā)生變化（降低），所以在滅菌前用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH，或在培養(yǎng)基中加入磷酸緩沖液以穩(wěn)定pH。培養(yǎng)基配置3生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類在迅速流動水中生長的藻在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類21一、藻類粗放培養(yǎng)、保存生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養(yǎng)比較容易。取到實驗室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內(nèi)。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達(dá)到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進(jìn)入容器中。細(xì)微的藻類如團(tuán)藻目、硅藻門能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實驗室中保存很多年。1.在靜水中2.在迅速流動水中01在迅速流動水中生長的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因為它們要求經(jīng)常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。02為了把這些藻類保存到實驗時，應(yīng)當(dāng)把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內(nèi)，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結(jié)起來，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類時，應(yīng)盡可能創(chuàng)造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養(yǎng)在從采集藻類那一水域取來的水中，或其他天然水（尤其不能用自來水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長時間，或加以煮開），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機(jī)物質(zhì)所必需的礦質(zhì)鹽構(gòu)成。3.培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類二.預(yù)備培養(yǎng)液用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對一些難以培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預(yù)備培養(yǎng)液營養(yǎng)成分濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進(jìn)去，放在合適溫度下或室內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應(yīng)該每天搖動一次。有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機(jī)物，補(bǔ)充微量元素和輔助生長物質(zhì)，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農(nóng)田和庭院土）。再加入水使達(dá)5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進(jìn)行滅菌。3.土壤抽出液制作實驗四單細(xì)胞培養(yǎng)液一母液的配制單細(xì)胞藻大量生長繁殖,必須從環(huán)境中吸收各種營養(yǎng)元素,包括氮、磷、鐵和微量元素等單細(xì)胞藻在不同配方的培養(yǎng)液中生長效果不同,因此要根據(jù)各種單細(xì)胞藻的生理需求選擇合適的培養(yǎng)液把營養(yǎng)元素根據(jù)培養(yǎng)液配方進(jìn)行髙濃度配合(而且稀釋液用蒸餾水或去離子水),一般濃縮1000倍,配成母液。目的是培養(yǎng)方便,母液不能直接用于培養(yǎng)單細(xì)胞藻類,必須稀釋后才用。一般每升消毒海水或淡水中加入1m母液,即為培養(yǎng)液一、實驗?zāi)康恼莆张囵B(yǎng)液配制的原理、一般方法和步驟,為今后成功培養(yǎng)單細(xì)胞藻打基礎(chǔ)。二、實驗原理和基礎(chǔ)知識三、實驗用品：1、實驗器材電子天平、電爐、容量瓶、燒杯、攪拌棒、試劑瓶、100m量筒、吸管l0ml移液管、耳球、微量注射器2、藥品NaNO3、(NH2)2CO、KH2PO4、FeSO47H2O、MnSOEDTA-Na2、ⅤB1、VB12、Na2SiO3、實驗材料

蒸餾水四、實驗操作步驟1.“寧波大學(xué)3號”培養(yǎng)液配方(母液)NaNo3:100gFeso4.7H2O：2.5gKH2PO4

：10gMnSO4：0.25gEDTA-Na2：20g VB1：60mgVB12：50ug蒸餾水1000ml◆培養(yǎng)海水綠藻類、金藻類、硅藻類等使用。在培養(yǎng)硅藻時在此基礎(chǔ)上加入0.02g/LNa2sio3,培養(yǎng)螺旋藻時應(yīng)加29/L的NaHco3。配制步驟(2)壓緊容量瓶蓋,將容量瓶上下顛倒n次,使其混合均勻,倒進(jìn)經(jīng)消毒的試劑瓶內(nèi),并貼上標(biāo)簽(母液名稱、配制人、日期)。（1）稱量和溶解配制母液100ml。按配方先稱取NaNo3放入干凈的燒杯中,加入約60ml蒸餾水,攪拌使NaNo3完全溶化。然后再依次稱取其他各成分,逐一溶解,最后一起倒入100ml容量瓶,再用蒸餾水沖洗燒杯2-3次,并轉(zhuǎn)移到容量瓶中,最后用蒸餾水加至刻度。(在本配方中FeSO4、Mnso4應(yīng)與EDTA-Na2一起加熱溶解)（3）配制0.5%Na2Sio3稱05gNa2Sio3置于干凈的燒杯中,加入約60ml蒸餾水,攪拌溶解,倒進(jìn)100ml容量瓶,用蒸餾水沖洗燒杯2-3次并轉(zhuǎn)移至容量瓶中,定容100ml。上下顛倒容量瓶n次使其混合均勻,倒進(jìn)經(jīng)消毒的試劑瓶內(nèi),并貼上標(biāo)簽(貯液名稱、濃度、配制人、日期)配制母液應(yīng)注意事項1各種營養(yǎng)鹽應(yīng)逐一稱量、逐一溶解,倒進(jìn)容量瓶定容,然后再倒入試劑瓶保存。2.稀釋液必須加蒸餾水或去離子水3.難溶解的物質(zhì)必須與EDTA-Na2一起絡(luò)合加熱溶解4待溫度冷卻至低于60℃時,才能加入維生素,以免失效。5注意加入燒杯中溶化營養(yǎng)鹽的水量應(yīng)少于所需要定容的水【作業(yè)與思考】1.單細(xì)胞藻類培養(yǎng)液配制的操作過程中應(yīng)注意什么問題?2.單細(xì)胞藻類的全培養(yǎng)液配方應(yīng)包含哪些成分?3.試述該配方中的N、P比是多少?根據(jù)具體要求，培養(yǎng)基需配制成固體、半固體、液體狀。培養(yǎng)基配置配制固體培養(yǎng)基時是在相同成分的液體培養(yǎng)基中加入1.5%~2.0%的瓊脂培養(yǎng)基配置半固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入0.3%~0.6%的瓊脂。培養(yǎng)基配置接種3藻種質(zhì)量藻種數(shù)量接種時間藻類接種，就是將選好的藻種添加到新配好的培養(yǎng)液中。成功接種的關(guān)鍵是把握好：21一、藻種質(zhì)量藻種質(zhì)量，對培養(yǎng)效果影響很大，一般要求選取生活力強(qiáng)，生長旺盛的藻種。常用判別藻種的質(zhì)量主要從外觀和鏡檢二個方面考慮?？搭伾此蟹植伎锤奖诔恋礴R檢判斷藻種質(zhì)量水中分布情況，有運動能力的種類上浮活潑運動；無運動能力的種類均勻懸浮于水中看附壁和沉淀情況，好的藻種無明顯附壁，無大量沉淀。看顏色是否正常，正常情況下，綠藻類呈鮮綠色，硅藻類呈黃褐色，金藻類呈金褐色好的藻種細(xì)胞顏色鮮艷，運動種類運動活潑，無雜藻和敵害生物存在。

藻種藻液的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到收獲的濃度或接近收獲的濃度。常用培養(yǎng)種要求達(dá)到的藻種密度：亞心形扁藻：30～40萬個細(xì)胞/ml以上三角褐指藻：300萬個細(xì)胞/ml以上球等鞭金藻：250萬個細(xì)胞/ml以上二、接種數(shù)量1.接種藻液的濃度一、是藻種處于指數(shù)生長期，生長繁殖旺盛二、是利用藻細(xì)胞分泌的較大量的胞外產(chǎn)物對污染生物進(jìn)行抑制

2.接種比例接種比例為藻種藻液量與培養(yǎng)液量的比例。接種比例大，可使培養(yǎng)液中的藻類一開始就占優(yōu)勢，有兩方面作用：一是可對其他可能污染的生物起抑制作用；二是可縮短培養(yǎng)周期。在環(huán)境因子不很適宜，藻類生長不良，敵害生物大量出現(xiàn)的可能性較大時，高比例的接種量尢為重要。保種培