galecin-7在eca-1049細(xì)胞中的表達(dá)及意義

galecin-7在eca-1049細(xì)胞中的表達(dá)及意義

癌癥是人類常見的腫瘤之一。在中國大陸地區(qū),食管癌的主要類型為鱗狀細(xì)胞癌,發(fā)病率居全國惡性腫瘤第五位,死亡率居第四位Galectin-7屬于半乳凝素族的一員,具有高度的組織特異性,其表達(dá)大多局限于復(fù)層上皮細(xì)胞中大量的文獻(xiàn)已經(jīng)證實了半乳凝素在細(xì)胞凋亡中的作用?；贕alectin-7與其同族蛋白質(zhì)具有共同功能的理論,大量的研究都集中在Galectin-7對于細(xì)胞凋亡的作用。Galectin-7在DLD-1細(xì)胞中的異位表達(dá),使DLD-1細(xì)胞對許多不同的凋亡刺激更敏感,而過表達(dá)Galectin-7的轉(zhuǎn)染組DLD-1細(xì)胞比空載體組細(xì)胞增殖顯著降低考慮到Galectin-7與細(xì)胞凋亡的聯(lián)系以及抗增殖的作用,它應(yīng)該對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到抑制的作用。然而通過幾種實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)的觀察發(fā)現(xiàn),在腫瘤中Galectin-7表達(dá)增加,并且可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)研究人員普遍認(rèn)為,半乳凝素存在于細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。雖然它們不是分泌蛋白,但半乳凝素可通過非經(jīng)典分泌途徑或是富含半乳凝素的囊泡分泌到細(xì)胞外。因此,它們常在正?；颊吆湍[瘤患者的血清中被發(fā)現(xiàn)。例如,正常人的血清里就能檢測到Galectin-3的存在,而在患有惡性疾病的患者血清中能檢測到顯著高于正常水平的Galectin-3本研究擬使用食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109為研究對象,檢測其細(xì)胞上清液中Galectin-7的表達(dá),并通過重組Galectin-7培養(yǎng)細(xì)胞觀察其在細(xì)胞外的具體作用及其可能的機制。1材料和方法1.1試劑與儀器Eca-109由中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。胎牛血清(FBS)購于四季青公司;改良型1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司;重組人半乳凝集素-7購于優(yōu)爾生公司;β-乳糖(β-lactose)購于上海廣銳生物科技有限公司;青霉素和鏈霉素購于碧云天生物公司;總RNA提取試劑盒購于Omega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGREENI購于TaKaRa公司;兔抗人Galectin-7(Galectin-7)、基質(zhì)金屬酶-9(MMP-9)、p38、pp38抗體購于Proteintech公司;兔抗人β-actin抗體購于鼎國生物公司;HRP標(biāo)記二抗(IgG)購于Proteintech公司;超濾離心管(molecularweightcutoffof3kDa)購于Millipore公司;一抗/二抗洗脫液購于碧云天公司;MTT購于Amresco公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2重組galectin-7的培養(yǎng)Eca-109細(xì)胞株常規(guī)采用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),在各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入不同劑量的重組Galectin-7,培養(yǎng)條件為37°C、飽和濕度及5%CO對照組:NC組(無處理組);濃度實驗組時間實驗組:對照組和濃度實驗組培養(yǎng)細(xì)胞24h,時間實驗組分別培養(yǎng)8,16,24h。1.3galectin-7是在細(xì)胞外清液中檢測的1.3.1離心社會化處理收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液10mL,10000r/min離心5min×3,以去除細(xì)胞碎片。將上清液加入內(nèi)管,14520r/min離心(4°C預(yù)冷)30min,即得濃縮10倍的細(xì)胞上清液。離心結(jié)束,將內(nèi)管倒置在另一離心管中,5000r/min離心5min后,收集濃縮液約1000μL。取800μL按上述方式以14520r/min離心5min,濃縮成400mL20倍濃縮上清液。多次超濾離心后可得到40倍、80倍的濃縮上清液。1.3.2對照組細(xì)胞蛋白質(zhì)提取收集對照組細(xì)胞1×101.4實時、定量pcr檢測pmp-9mnmra的發(fā)現(xiàn)1.4.1總rna提取及紫外分光光度計算按照OMEGAE.Z.N.ATotalRNAKit說明書,將各實驗組及對照組細(xì)胞分別提取總RNA,紫外分光光度計定量并計算D1.4.2逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行分析采用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTReagentKit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄:依次加入2μL5×PrimeScriptBuffer、0.5μLOligodTPrimer、0.5μLRandom6mers、0.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixI,最后加入RNaseFreedH1.4.3熒光定量pcr檢測參照TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqII說明書,以GAPDH為內(nèi)參。MMP-9上游引物序列為:5′-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3′;下游引物序列為:5′-ACTGAGGAATGATCTAAGCCC-3′;擴增片段長度為:263bp。GAPDH上游引物序列為:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;下游引物序列為:5′-TCTAGAGGGCAGGTCAGGTCCACC-3′,擴增片段長度為231bp。使用美國Bio-Rad公司iCycleriQ熒光定量PCR分析儀進(jìn)行PCR反應(yīng),擴增條件為:95°C預(yù)變性2min;95°C10s,55°C15s,72°C15s,完成40個循環(huán)。擴增結(jié)束后,PCR儀自動繪制熔解曲線,鑒定產(chǎn)物的特異性。通過21.5許氏詞合板顯示了mmp-9、pp38和p38的性能1.5.1提取的蛋白質(zhì)收集各實驗組細(xì)胞1×101.5.2galectin-7多克隆抗體的制備各組細(xì)胞蛋白液經(jīng)過BCA法蛋白定量后,取25μL加入5×上樣緩沖液,于95°C水浴5min后上樣。然后行8%的SDS凝膠電泳,再進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,電轉(zhuǎn)完畢后將PVDF膜用5g/L脫脂奶粉常溫封閉2h,加入兔抗人Galectin-7多克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體于4°C孵育過夜。NC組及g1.6細(xì)胞成像試驗檢查細(xì)胞移植能力將對數(shù)期Eca-109細(xì)胞接種到六孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為5×101.7mtt法測定細(xì)胞克隆取對數(shù)生長期Eca-109細(xì)胞,用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化。10%RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×101.8數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理,比較各組間的差異有無顯著性,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1al明法中g(shù)alectin-7的表達(dá)Westernblot檢測超濾離心濃縮細(xì)胞上清液與對照組細(xì)胞中Galectin-7的表達(dá),結(jié)果顯示(圖1),在濃縮80倍的上清中檢測到了Galectin-7的表達(dá),明顯低于對照組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(由于是檢測細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá),故沒有內(nèi)參的條帶)。2.2在不同的galectin-7濃度和時間培養(yǎng)條件下，mmp-9在mrna和蛋白質(zhì)水平上的發(fā)現(xiàn)差異為分析Galectin-7在Eca-109中誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)與培養(yǎng)時間的關(guān)系,我們通過實時熒光定量PCR檢測g2.3添加galectin-7來培養(yǎng)細(xì)胞，并改變p38路徑蛋白質(zhì)Westernblot檢測NC組細(xì)胞和g2.4galectin-7對eca-119細(xì)胞遷移能力的影響為觀察Galectin-7對Eca-109細(xì)胞遷移能力的影響,我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實驗,實驗結(jié)果顯示,不同Galectin-7濃度下Eca-109細(xì)胞遷移能力均有增強,增強幅度與濃度正相關(guān)(圖3)。2.5在不同濃度下融合galectin-7培養(yǎng)下腫瘤細(xì)胞生長將NC、g3galectin-7對垃圾污染的細(xì)胞外轉(zhuǎn)移作用在本研究中,為了了解Galectin-7是否存在于細(xì)胞外,我們使用超濾離心技術(shù)對Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行了濃縮,通過免疫印跡實驗,在80倍濃縮的上清液中發(fā)現(xiàn)了Galectin-7的存在,從而證明了我們的猜想。這一結(jié)果也表明Galectin-7與其他半乳凝素族蛋白一樣都可以被細(xì)胞分泌到細(xì)胞外,從而拓展了研究的途徑和方向。Galectin-7在細(xì)胞中的作用,不再局限于細(xì)胞內(nèi),其細(xì)胞外的作用更值得關(guān)注?；啄な亲钃跄[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要組織屏障之一,IV型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中,細(xì)胞外基質(zhì)的降解為腫瘤細(xì)胞的移動打開通道,腫瘤細(xì)胞可以釋放各種蛋白水解酶降解在侵襲和轉(zhuǎn)移中遇到的不同組織屏障。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種,是IV型膠原的主要水解酶,因此,MMP-9可以通過水解IV型膠原,從而達(dá)到降解ECM及基底膜的目的,使腫瘤細(xì)胞沿著基底膜缺損和基質(zhì)空隙侵入周圍組織及血管。在本研究中,我們觀察到將重組人Galectin-7加入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞后,MMP-9無論在基因水平還是蛋白水平都出現(xiàn)了顯著的相應(yīng)的上升,表明細(xì)胞外的Galectin-7參與了MMP-9的表達(dá)調(diào)控。在加入β-lactose后對MMP-9的作用出現(xiàn)了抑制,提示Galectin-7誘導(dǎo)MMP-9的作用位點可能與細(xì)胞膜上的特異性糖基受體有關(guān)。而與對照組相比,實驗組細(xì)胞中pp38表達(dá)水平上升明顯,提示Galectin-7可能激活了p38MAPK通路,從而提高了MMP-9的表達(dá),這一發(fā)現(xiàn)與Park等為進(jìn)一步研究Galectin-7在食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用,我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實驗。實驗結(jié)果表明,Galectin-7使得實驗組Eca-109細(xì)胞的體外遷移能力較對照組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的上升,并且與Galectin-7的濃度正相關(guān),從而進(jìn)一步證實了Galectin-7在食管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。而在MTT實驗中我們發(fā)現(xiàn),加入不同濃度的重組Galectin-7培養(yǎng)細(xì)胞后,與對照組對比,在5d內(nèi)各實驗組細(xì)胞的增殖情況幾乎一致,說明Galectin-7在細(xì)胞外對于細(xì)胞增殖沒有明顯的作用。我們的研究結(jié)果表明,Galectin-7在食管鱗癌細(xì)胞中通過非經(jīng)典途徑分泌到細(xì)胞外,通過結(jié)合細(xì)胞膜上的特異性糖基受體激活了p38MAPK通路,從而提高了MMP-9的表達(dá),增強了細(xì)胞的侵襲遷移能力。而對于食管鱗癌增殖能力并沒有明顯影響,這可能與蛋白存在的位置及細(xì)胞的惡性程度有關(guān),在正常上皮細(xì)胞的表達(dá)中,Galectin-7定位于細(xì)胞內(nèi)部,發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞分化,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。當(dāng)上皮細(xì)胞出現(xiàn)癌變后,由于基因的改變,Galectin-7受體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低,進(jìn)而使其維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能缺失。Galectin-7被細(xì)胞分泌到胞外通過結(jié)合特異性糖基受體促進(jìn)MMP-9的表達(dá)。近年來,癌癥相關(guān)的蛋白糖基化的改變已經(jīng)引起了很多關(guān)注。因此,對糖蛋白上的糖類具有高度特異性的結(jié)合蛋白(凝集素)已經(jīng)作為癌癥和大量疾病的標(biāo)志物,也可以作為治療靶點,這對于半乳糖凝集素家族的成員尤其如此1.3.3pvdf蛋白凝膠的制備將40