微生物生長與培養(yǎng)技術(shù)-微生物生長規(guī)律

生長量測定法1.稱干重稱干重可用離心法或過濾法測定，是一種常用的方法。一般細菌干重約為濕重的20~25%。在離心法中，將待測菌液置入離心管中，用清水洗滌，離心1~5次后，進行干燥，然后稱干重。在過濾法中，過濾后的細胞用少量清水洗滌，干燥后稱取干重。2.比濁法微生物生長會引起培養(yǎng)物渾濁度的增高。菌懸液中的細胞濃度與其渾濁度成正比，與透光度成反比。用分光光度計可以測出培養(yǎng)液的光密度值，反映菌體的數(shù)量。此方法雖然靈敏度較差，然而簡便、迅速、不干擾或不破壞樣品。3.體積測量法又稱為菌絲濃度法。通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。該測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但由于離心沉淀物中夾雜有固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有偏差。計數(shù)法二、計數(shù)法1.稀釋平板菌落計數(shù)法:這是最常用的活菌計數(shù)法。取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在其凝固前均勻混合，或涂布于已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。在最適條件下培養(yǎng)，通過平板上形成的菌落數(shù)，推算出待測菌液中活細胞的數(shù)量。此方法要求菌體成分散狀態(tài)，否則無法確定單個菌落是否由單個細胞形成。2.計數(shù)器計數(shù)法:血球計數(shù)板是用來測定一定容積中的細胞總數(shù)目的常規(guī)方法。在顯微鏡下計數(shù)一定體積重的平均細胞數(shù)，換算出待測菌液中的細胞總數(shù)。該方法的特點是測定簡便、快速。但測定的對象有一定的局限性，只適合于個體較大的微生物種類（如酵母等），且不適于測定可游動微生物。此外，此方法測定的結(jié)果為微生物總數(shù)，其中包括已死亡的個體，不能直接反映活細胞的數(shù)量。3.膜過濾法:測定水與空氣中的活菌數(shù)量時，由于含菌濃度過低，則可先將待測樣品通過微孔薄膜過濾濃縮，然后把濾膜放在適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出菌落后即可計數(shù)。此法適用于測定量大、含菌濃度低的流體樣品。生理指標(biāo)法1.含氮量測定法大多數(shù)微生物含氮量固定，如細菌含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量2.還原糖測定法還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。3.其他生理指標(biāo)法碳、磷、DNA、RNA、ATP、乙酰胞壁酸等含量及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、黏度、產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長量的測定。

謝謝觀看微生物的生長規(guī)律微生物細胞數(shù)量的增加稱為微生物群體生長。由于微生物個體微小的特殊性，難以針對單個微生物細胞或個體的生長繁殖的研究進行，故除特定的研究目的外，一般所言的微生物生長是指群體生長。單細胞微生物與多細胞微生物的群體生長表現(xiàn)出不同的生長趨勢。但就單細胞微生物而言，在特定的環(huán)境中，不同的微生物表現(xiàn)出趨勢相近的生長動力學(xué)規(guī)律。當(dāng)把少量純種單細胞微生物接種到液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。如以細胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，就可畫出一條定量描述液體培養(yǎng)基中微生物生長規(guī)律的實驗曲線，稱為生長曲線。根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)，即每小時分裂次數(shù)的不同，可將生長曲線分為遲緩期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。生長曲線1.遲緩期

又稱為延滯期、適應(yīng)期。指少量單細胞微生物接種到新培養(yǎng)基中，在開始培養(yǎng)一段時間內(nèi)細胞數(shù)目不增加或增加非常緩慢的時期。該時期有以下特點：①生長繁殖速度幾乎為零；②細胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成長絲狀；③細胞內(nèi)RNA，尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；⑤細胞對外界理化因子（如NaCl，熱、紫外線、抗生素等）的抵抗力減弱。在工業(yè)發(fā)酵和科研中遲緩期會增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響，但是遲緩期無疑是必需的，因為細胞分裂之前，細胞各成分的復(fù)制與裝配等也需要時間，因此可采取一定的措施縮短遲緩期：①通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；②利用對數(shù)生長期的細胞作為“種子”，代謝旺盛、生命力強，可以大大縮短遲緩期；③接種到營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中的微生物要比接種到營養(yǎng)單調(diào)的合成培養(yǎng)基中的遲緩期短。新接種的培養(yǎng)基與菌種的原培養(yǎng)基越接近，遲緩期越短。因此在發(fā)酵生產(chǎn)中，常使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基的成分盡量接近；④接種量的大小明顯影響遲緩期的長短。接種量越大，遲緩期越短。因此在發(fā)酵工業(yè)中，為提高發(fā)酵速率，一般采用1/10的接種量。2.對數(shù)期指數(shù)期的微生物具有整個群體的生理特性較一致、細胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優(yōu)點，是用作代謝、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌體的最適宿主，也是發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最佳材料。

又稱指數(shù)生長期。是指在生長曲線中，緊接著遲緩期的一個細胞以幾何級數(shù)速度分裂的一段時間。對數(shù)期有以下幾個特點：①生長繁殖的速度很快，活菌的數(shù)目呈對數(shù)增長，因而細胞每分裂一次所需的代時或原生質(zhì)增加1倍所需的時間最短，并且在這個時期均勻一致；②細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)各種成分最為均勻；③酶系活躍，代謝旺盛；④菌體細胞形態(tài)特征均勻一致，最代表種的特征；⑤此期間的微生物細胞的生化特征性均勻一致，典型。

影響微生物世代時間的因素較多，主要有：①菌種。不同菌種的代時差別極大，如在相同的條件下，大腸桿菌只要17分鐘，霍亂弧菌為21~38小時；②環(huán)境條件。同一種細菌，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長，其代時較短，反之較長。③營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。在營養(yǎng)物質(zhì)濃度很低的情況下，營養(yǎng)物的濃度才會影響生長速率，隨著營養(yǎng)物濃度逐步增高，生長速率不受影響，而只影響最終的菌體產(chǎn)量；如果進一步提高營養(yǎng)物的濃度，則生長速率和菌體產(chǎn)量兩者均不受影響。凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物，就稱為生長限制因子。④培養(yǎng)溫度。溫度對微生物的生長速率有極其明顯的影響

由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于微生物生長，使微生物細胞的生長速率降低，處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等。此期間活菌數(shù)達到最高峰，且保持相對穩(wěn)定。進入穩(wěn)定期時，細胞內(nèi)開始積累糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物；芽孢桿菌一般在此期間開始形成芽孢；有的微生物在這時開始以初生代謝物作為前體，通過復(fù)雜的次生代謝途徑合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物。在此時期，細胞的4.衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，微生物細胞死亡速率逐步超過細胞的繁殖速率，軀體中活細胞逐步減少，曲線下滑，標(biāo)志著衰亡期的到來。該時期微生物有以下幾個特點：①細菌出現(xiàn)自溶現(xiàn)象；②菌體細胞形態(tài)和大小出現(xiàn)異常，呈畸形；③革蘭氏染色結(jié)果會發(fā)生改變。次級代謝產(chǎn)物大量積累，菌體細胞的總數(shù)也達到高峰，穩(wěn)定期是代謝產(chǎn)物和大量的活菌體的最佳收獲期。。生產(chǎn)上常常通過補料，調(diào)節(jié)pH，調(diào)整溫度等措施來延長穩(wěn)定生長期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。3.穩(wěn)定期4.衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，微生物細胞死亡速率逐步超過細胞的繁殖速率，軀體中活細胞逐步減少，曲線下滑，標(biāo)志著衰亡期的到來。該時期微生物有以下幾個特點：①細菌出現(xiàn)自溶現(xiàn)象；②菌體細胞形態(tài)和大小出現(xiàn)異常，呈畸形；③革蘭氏染色結(jié)果會發(fā)生改變。生長曲線指導(dǎo)意義通過對微生物生長曲線的分析，可見：①微生物在對數(shù)生長期生長速率最快；②營養(yǎng)物的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，以及因此引起的培養(yǎng)條件的變化，是限制培養(yǎng)液中微生物繼續(xù)快速增殖的主要原因；③用生活力旺盛的對數(shù)生長期細胞接種，可以縮短延遲期，加速進入對數(shù)生長期；④補充營養(yǎng)物，調(diào)節(jié)因生長而改變了環(huán)境pH、氧化還原電位，排除培養(yǎng)環(huán)境中的有害代謝產(chǎn)物，可延長對數(shù)生長期，從而提高培養(yǎng)液菌體濃度與有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；⑤對數(shù)生長期以菌體生長為主，穩(wěn)定期以代謝產(chǎn)物合成與積累為主。根據(jù)發(fā)酵目的的不同，確定在微生物發(fā)酵的不同時期進行收獲。生長曲線可以用于指導(dǎo)微生物發(fā)酵工程中的工藝條件優(yōu)化以獲得最大的經(jīng)濟效益。謝謝顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。原理：血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格（圖）；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lmL菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A?B（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A?B（個）血球計數(shù)板結(jié)構(gòu)圖2-64血細胞計數(shù)板的構(gòu)造方法與步驟：（一）菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。（二）鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。（三）加樣品將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。（四）顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)