細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定技術(shù)-鱟試劑靈敏度復(fù)核和方法驗(yàn)證試驗(yàn)

知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)一、鱟試劑及鱟試劑靈敏度鱟血含銅藍(lán)蛋白，呈藍(lán)色。鱟試劑由鱟血制備而成，是從鱟血的變形細(xì)胞裂解物中提取制備而來。鱟試劑根據(jù)鱟的種類不同科分為美洲鱟試劑、中國(guó)鱟試劑、圓尾鱟試劑；根據(jù)鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)的專一性不同，可分為普通鱟試劑和特異性鱟試劑。

知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)鱟試劑的規(guī)格指每支鱟試劑的裝量，一般來說，規(guī)格是多少，就用多少細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶試劑使用。在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條件下使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

二、鱟試劑靈敏度的復(fù)核在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。復(fù)核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

（一）稀釋標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四種濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行做4管，另外2管陰性對(duì)照（共18管）。37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度，從凝膠是否變形和滑落判斷試驗(yàn)結(jié)果。注意保溫和拿取試管的過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)（二）結(jié)果判斷：

若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。結(jié)果計(jì)算：

反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。知識(shí)點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)當(dāng)λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于內(nèi)毒素檢查。但是注意要以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)一、干擾試驗(yàn)是為了確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為產(chǎn)品能否用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)，并且驗(yàn)證供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來源改變或供試品陽性對(duì)照結(jié)果呈陰性時(shí)，供試品是否存在干擾作用。

使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。

知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按下表制備溶液A、B、C和D。同時(shí)制備2支供試品陰性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。二、凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)溶液的制備知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)三、結(jié)果判斷：

當(dāng)供試品陰性對(duì)照和水陰性對(duì)照都為陰性，并且細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解的內(nèi)毒素系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)

分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)

當(dāng)Es在0.5λ和2λ（包括0.5λ和2λ）之間、Et在0.5Es至2Es(包括0.5Es和2Es）之間時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。三、光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度。按表制備溶液A、B、C和D。編號(hào)內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為λm）供試品溶液至少2C至少3個(gè)濃度（最低一點(diǎn)設(shè)定為λ）檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少2A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。B為加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知濃度內(nèi)毒素的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D為陰性對(duì)照。

知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)二、計(jì)算

按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒紊含量Ct計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。

知識(shí)點(diǎn)：干擾試驗(yàn)三、結(jié)果判斷：當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50％～200％之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。反之，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素，并重復(fù)干擾試驗(yàn)。

技能點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作規(guī)程一、靈敏度復(fù)核的操作

1．

取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的l0mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放人37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。技能點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作規(guī)程

2、將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放人37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

3、將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度，從凝膠是否變形和滑落判斷試驗(yàn)結(jié)果。注意保溫和拿取試管的過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

技能點(diǎn)：鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作規(guī)程3、結(jié)果判斷：

若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。4、結(jié)果計(jì)算：

反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素