咔唑法測定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的含量

咔唑法測定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的含量周葉;趙婷;馮偉偉;李蕓子;但招陵;劉治華;仰榴青【摘要】[Objective]TheaimwastodevelopaspectrophotometrymethodforthedeterminationofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilage.[Method]ChondroitinsulfatewasextractedfromChinesesturgeoncartilagebvthedilutealkali-enzymehydrolysismethod.ThecontentofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilagewasdeterminedbythecarbazolemethodandD-glucuronicacidwasusedasreferencestandard.Acolorreactionwasmadewithcarbazoleusingborax-sulfuricacidasmedium.Theabsorbancewasdeterminedat530nmandthecontentofD-glucuronicacidwascalculatedbyusingthestandardcurve,andthenconvertedintothecontentofchondroitinsulfate.Thedistilledwaterwastakenastheblankcontrol.[Result]Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof10-50pg/mlforD-glucuronicacidandtheregressionequiationwasY=0.015X-0.037,r=0.9997.Theaveragerecoveriesforthreedifferentconcentrationswere100.87%,100.73%and101.29%(n=5),andtherelativestandarddeviationswere2.74%,2.56%and2.22%,respectively.[Conclusion]Themethodwasfastandhadgoodreproducibility.ItcanbeusedtodeterminethecontentofchondroitinsulfatefromChinesesturgeoncartilage.%[目的]建立分光光度法測定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素含量的方法、[方法]采用堿提-酶解法提取中華鱘軟骨中硫酸軟骨素，采用咔唑法，以D-萄萄糖醛酸為標準品，在硼砂-濃硫酸介質(zhì)中經(jīng)咔唑顯色后,以蒸餾水為空白,于波長530nm處分別測定對照品溶液和供試品溶液的吸光度，按標準曲線計算葡萄糖醛酸含量,進而轉(zhuǎn)換為硫酸軟骨素含量.［結(jié)果］D-葡萄糖醛酸在10~50pg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.015X-0.037(r=0.9997),3個不同濃度的加樣回收率分別為100.87%、100.73%和101.29%(n=5),RSD值分別為2.74%、2.56%和2.22%.［結(jié)論］該方法快速，重現(xiàn)性好,可用作中華鱘軟骨中硫酸軟骨素含量的測定.【期刊名稱】《安徽農(nóng)業(yè)科學》【年(卷)，期】2011(039)019【總頁數(shù)】2頁(P11597-11598)【關(guān)鍵詞】咔唑法;硫酸軟骨素；D-萄糖醛酸;中華鱘軟骨;含量測定【作者】周葉;趙婷;馮偉偉;李蕓子;但招陵;劉治華;仰榴青【作者單位】江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院，江蘇，鎮(zhèn)江,212013;江蘇大學藥學院,江蘇,鎮(zhèn)江,212013【正文語種】中文【中圖分類】R282.74;R927.2;TS254.2中華鱘(Chinesesturgeon)，隸屬鱘形目、鱘科、鱘屬，是我國特有的3種鱘之一，為國家一級保護動物，具有水中〃活化石”之稱。中華鱘不僅具有很好的營養(yǎng)價值，而且也具有獨特的醫(yī)藥和保健價值，硫酸軟骨素(Chondroitinsulfate,CS)即為其中最重要的物質(zhì)之一。近年來，研究表明硫酸軟骨素具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗凝血和軟骨保護等多種生物活性［1］，有重要的研究和應(yīng)用價值。CS測定方法有許多種，但其測定原理均是基于組成的糖單位（D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖）、硫酸基以及酸性粘多糖等大分子性質(zhì)［2-3］,其中咔唑法測定硫酸軟骨素已應(yīng)用于鯊魚及豬骨中［4-5］。但目前關(guān)于咔唑法用于中華鱘軟骨中CS含量測定還未見報道。筆者采用咔唑法，以D-葡萄糖醛酸為標準品，對中華鱘軟骨中葡萄糖醛酸的測定進行方法學考察，再計算硫酸軟骨素含量，為中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的提取工藝研究提供簡便、快速的測定方法。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑。D-葡萄糖醛酸、咔唑，四硼酸鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。1.1.2儀器。UV-7502PC可見分光光度計，購自上海茂欣儀器有限公司;Sigma1-13高速臺式離心機，購自SIGMA公司;FD-1-50冷凍干燥機，購自北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。1.2方法1.2.1中華鱘軟骨硫酸軟骨素的制備。稱取已脫脂的中華鱘軟骨粉末適量，按一定的料液比，在一定濃度的NaOH溶液中于40°C恒溫提取一定時間后，冷卻，離心,得到軟骨堿提液;堿提液調(diào)節(jié)pH至2~3,加入胃蛋白酶在37C進行酶解4h后，將溫度調(diào)至85C滅酶20min，離心后將上清液減壓濃縮，加95%乙醇，使其終濃度為80%進行沉淀后，所得沉淀經(jīng)離心、冷凍干燥后即得硫酸軟骨素粗品。得到的3批粗品編號分別為100411、100412和100413。1.2.2溶液的配制。①D-葡萄糖醛酸標準溶液。準確稱取0.0100g經(jīng)105C干燥至恒重的D-葡萄糖醛酸標準品于100ml容量瓶中，水溶解定容。②供試品溶液。準確稱取硫酸軟骨素樣品0.0200g于100ml容量瓶中，水溶解定容，待測。③咔唑試劑。準確稱取0.1250g咔唑于100ml棕色容量瓶中，無水乙醇溶解定容，冰箱保存。④硼砂-濃硫酸試劑。稱取4.7671g四硼酸鈉，置于500ml棕色容量瓶中，用濃硫酸溶解并定容，冰箱保存。1.2.3標準曲線的繪制。分別準確量取D-葡萄糖醛酸標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于10ml容量瓶中，加蒸餾水定容，得到一系列濃度的D-葡萄糖醛酸標準溶液。將裝有5.0ml硼砂-硫酸試劑的試管，于冰浴條件下分別加入不同濃度的D-葡萄糖醛酸標準溶液各1.0ml，于沸水浴中加熱10min，取出迅速冷卻至室溫。向水解液中加入咔唑試劑0.2ml，搖勻后置于沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，在530nm波長處分別測定吸光度（A）。以吸光度為縱坐標，D-葡萄糖醛酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。1.2.4精密度試驗。分別量取標準溶液1.0、3.0和5.0ml置于10ml容量瓶中，蒸餾水定容，配成為10、30和50pg/ml的標準溶液。量取1.0ml標準溶液按照“1.2.3”中方法測定其吸光度，重復5次。1.2.5穩(wěn)定性試驗。取經(jīng)顯色后的硫酸軟骨素樣品溶液，在室溫下放置1h,分別在10、20、30、40、50、60min測定其吸光度值，觀察顯色后溶液是否穩(wěn)定。1.2.6重現(xiàn)性試驗。取同一批樣品（批號100411）5份，按供試品溶液制備后，按照“1.2.3”中方法測定樣品的吸光度。1.2.7加樣回收率試驗。采用加樣回收率法，準確量取供試品溶液0.5ml,分別加入濃度為10、30和50pg/ml標準品溶液0.5ml,重復5次，按“1.2.3”方法測定吸光度，計算其回收率。1.2.8樣品含量的測定。精確稱取不同批號（批號100411、100412和100413）的樣品配制成供試品溶液，按“1.2.3”方法測定各樣品的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算3批樣品中葡萄糖醛酸濃度求得葡萄糖醛酸含量，通過以下?lián)Q算公式得到硫酸軟骨素的含量［6］。硫酸軟骨素含量=葡萄糖醛酸含m/45.12%x100%(1)2結(jié)果與分析2.1標準曲線由圖1可知，D-葡萄糖醛酸濃度與吸光度在10~50pg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其標準曲線方程為Y=0.015X-0.037(r=0.9997),其中Y為吸光度，X為D-葡萄糖醛酸濃度(pg/ml)。圖1D-葡萄糖醛酸的標準曲線Fig.lCalibrationcurveofD-glucuronicacid2.2精密度試驗低、中、高3個不同濃度溶液的RSD值分別為1.45%、1.02%和1.16%，說明此方法的精密度良好。2.3穩(wěn)定性試驗RSD值為0.66%。吸收值變化很小，溶液吸光度在顯色40min內(nèi)基本保持不變，在lh內(nèi)吸光度約下降1.11%，表明溶液顯色后穩(wěn)定性良好。2.4重現(xiàn)性試驗RSD值為2.79%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。2.5加樣回收率試驗低、中、高濃度的加樣回收率分別為100.87%、100.73%和101.29%(n=5)，其RSD值分別為2.74%、2.56%和2.22%，說明該方法具有較高的回收率。2.6樣品含量的測定結(jié)果批號100411、100412及100413的葡萄糖醛酸含量分別是26.55%、26.58%和26.63%，其對應(yīng)的硫酸軟骨素含量分別為58.41%、58.48%和58.59%。3小結(jié)該試驗建立了采用咔唑法測定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的方法。D-葡萄糖醛酸濃度在10~50pg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.015X-0.037(r=0.9997),低、中、高3個不同濃度的加樣回收率分別為100.87%、100.73%及101.29%(n=5),其RSD值分別為2.74%、2.56%和2.22%，溶液lh內(nèi)穩(wěn)定性好。該方法操作簡單，不需要精密和貴重儀器，無需硫酸軟骨素標準品，重現(xiàn)性好，精密度高，可為中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的工藝研究提供簡便、快速的測定方法。參考文獻[1]孫豐梅.硫酸軟骨素的提取及其降血脂、抗氧化保健功能的研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學，2003.[2]謝繼青，王鳳仙，崔慧斐，等硫酸軟骨素含量測定操作條件的優(yōu)化[J].中國生化藥物雜志，2000