薄荷潤(rùn)唇膏微生物指示菌競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)

薄荷潤(rùn)唇膏微生物指示菌競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)

主要成分為：礦油、土壤蠟、礦脂、肉桂、肉桂枝、乙酰胺、水楊酸、羊毛脂、薄荷醇、樟腦、綠桉葉油、歐洲紅松葉油和水楊酸。由于含有大量油、酯類物質(zhì)，按化妝品微生物檢驗(yàn)1試驗(yàn)材料1.1xk137-717曼秀蕾敦(中國(guó))藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào):XK16-1081377，衛(wèi)妝準(zhǔn)字29-XK-0649，國(guó)妝特字G20100002，有效期:2020年10月。1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)基卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào):190221;SCDLP液體培養(yǎng)基，批號(hào):180202;孟加拉紅瓊脂，批號(hào):180119;雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，批號(hào):180609;Baird-Parker培養(yǎng)基，批號(hào):190122;甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基，批號(hào):180811;伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)，批號(hào):190827;十六烷三甲基溴化銨瓊脂，批號(hào):190813;pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液，批號(hào):20200312。均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。1.3菌株atcc大腸埃希菌[ATCC8739]、銅綠假單胞菌[ATCC27853]、枯草芽孢桿菌[ATCC6633]、金黃色葡萄球菌[ATCC6538]、白色念珠菌[ATCC10231]和黑曲霉[ATCC16404]。購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。1.4儀器、設(shè)備、儀器超凈工作臺(tái)(廠家:蘇州蘇凈、型號(hào):SW-CJ-2D型)、生物安全柜(廠家:ESCD、型號(hào):CLASS11BSC)、生化培養(yǎng)箱(廠家:上海一恒、型號(hào):BPMJ-250F)、壓力消毒器(廠家:松下、型號(hào):MSL-3781L-PC)、恒溫水浴鍋(廠家:杭州米歐儀器有限公司、型號(hào):WT100-2)、電冰箱(廠家:江蘇白雪、型號(hào):6C13080177)、顯微鏡(廠家:奧林巴斯、型號(hào):BX53+DP74)、電熱恒溫干燥箱(廠家:北京科偉永興儀器有限公司、型號(hào):101-3AB)、天平(廠家:諸暨超澤、型號(hào):JMA5001)。2方法和結(jié)果2.1病毒試驗(yàn)所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。2.2供試液的制備取薄荷潤(rùn)唇膏5g加到滅菌的三角瓶中，加入5mL滅菌吐溫-80，加入pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100mL，置于45℃水浴中，溶解，用勻漿儀混勻3min，制成1∶20g/mL供試液。2.3計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)1)試驗(yàn)組取1∶20g/mL供試液，分別加入5種試驗(yàn)菌株(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌懸液，制成含菌數(shù)小于100cfu的供試液，取含菌的樣品溶液1mL，每個(gè)菌液注2個(gè)平皿，注入所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。2)菌液對(duì)照組分別取5種實(shí)驗(yàn)菌的菌懸液(50～100cfu)1mL注皿，加培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。3)供試品對(duì)照組用供試品替代實(shí)驗(yàn)組液體注皿，實(shí)驗(yàn)。4)陰性對(duì)照組用同批配制、滅菌的SCDLP1mL替代樣品注皿，注入培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(1)的結(jié)果見表1。結(jié)果，采用1∶20g/mL的供試液1mL注皿，金黃色葡萄球菌的回收率小于50%，方法不可行。2.4計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)結(jié)果將供試液1∶20g/mL稀釋成1∶50g/mL和1∶100g/mL，加入金黃色葡萄球菌的菌懸液，進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(2)的結(jié)果見表2。結(jié)果，細(xì)菌總數(shù)采用1∶50g/mL的供試液1mL注皿，霉菌和酵母菌總數(shù)采用1∶20g/mL的供試液1mL注皿，回收率試驗(yàn)滿足指示菌挑戰(zhàn)性試驗(yàn)要求，檢驗(yàn)方法可行。2.5測(cè)定總scdlp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)液菌數(shù)1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入100mLSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入銅綠假單胞菌菌懸液1mL(小于100cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。2)陽(yáng)性對(duì)照。將銅綠假單胞菌菌懸液1mL(小于100cfu)加到100mLSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn);同時(shí)測(cè)定銅綠假單胞菌菌懸液菌數(shù)。3)供試品對(duì)照組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入100mLSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。4)陰性對(duì)照。同批配制、滅菌，100mLSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。銅綠假單胞菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果，見表3結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版銅綠假單胞菌常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，可以檢出試驗(yàn)菌-銅綠假單胞菌，方法可行。2.6金屬絲檢驗(yàn)方法的創(chuàng)新試驗(yàn)2.6.1細(xì)菌適用性試驗(yàn)1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入100mLSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液1mL(小于100cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌檢查項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)。2)陽(yáng)性對(duì)照將金黃色葡萄球菌菌懸液1mL(小于100cfu)加到100mLSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn);同時(shí)測(cè)定金黃色葡萄球菌菌懸液菌數(shù)。3)供試品對(duì)照組取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入100mLSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。4)陰性對(duì)照同批配制、滅菌100mLSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(yàn)(常規(guī)法)結(jié)果，見表4。結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌的常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，未檢出試驗(yàn)菌-金黃色葡萄球菌，方法不可行。2.6.2細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照、供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照組SCDLP液體培養(yǎng)基的體積采用300mL進(jìn)行金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版和《中國(guó)藥典》2015年版1106金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法，增加培養(yǎng)基體積，進(jìn)行挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，檢出試驗(yàn)菌-金黃色葡萄球菌，方法可行。2.7耐熱大腸菌群檢驗(yàn)1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入20mL雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)到滅菌的試管中，加入大腸埃希菌菌懸液1mL(小于100cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群檢查項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)。2)陽(yáng)性對(duì)照。將大腸埃希菌菌懸液1mL(小于100cfu)加到20mL雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn);同時(shí)測(cè)定大腸埃希菌菌懸液菌數(shù)。3)供試品對(duì)照組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20g/mL的供試液20mL加入20mL雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)到滅菌的試管中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。4)陰性對(duì)照。同批配制、滅菌20mL雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。耐熱大腸菌群方法適用性試驗(yàn)結(jié)果，見表6。結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群的常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，可以檢出試驗(yàn)菌-大腸埃希菌，方法可行。3挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果1)薄荷潤(rùn)唇膏由于含有大量脂溶性基質(zhì)，不易制備成均